分子诊断学技术在检验医学中的应用及挑战

方炳雄，翁锡泉，巴艳红综述，秦泽鸿审校

(普宁市人民医院检验科，广东普宁515300)

·综述·

分子诊断学技术在检验医学中的应用及挑战

方炳雄，翁锡泉，巴艳红综述，秦泽鸿审校

(普宁市人民医院检验科，广东普宁515300)

随着基因组学、生物信息学、蛋白质组学等多学科的交叉和融合，分子诊断学技术得到长足的发展。越来越多的分子诊断学技术应用于疾病的诊断、疗效监测和预后判断，这为检验医学的发展提供了新的机遇与挑战。本文就主要的分子诊断学技术在检验医学中的应用现状，以及面临的挑战进行阐述。

分子诊断学技术；检验医学；应用；挑战

DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.018

临床诊断疾病的手段，一般是通过检查患者血液、尿液、粪便以及其他分泌物等中的一些生命所需或分泌的物质如蛋白质、激素、电解质等大小分子的存在与否或含量多少，同时结合临床症状，来对某种疾病的发生发展、诊断预防和治疗预后，进行判断和监测[1]。随着分子生物学和分子遗传学的发展，越来越多的分子诊断学技术应用于疾病的诊断，彻底打破常规的诊断方式，不再以疾病的表型为主要依据推测疾病的发生发展及相关机制。分子诊断学技术，通过检测遗传物质的结构或表达水平，不但发现了疾病与特定基因存在、转录及表达有关，而且个体基因多态性与疾病特定用药密切相关。分子诊断，更注重个体基因差异，不仅对患者所患疾病做出判断，也可以对表型正常的携带者或特定疾病的易感人群做出预测。分子生物学技术在检验医学中的应用，为个性化医疗提供技术保障，降低患者的疾病治疗成本，减轻社会公共卫生负担。分子诊断学技术有力地推动了检验医学在疾病诊断和预后方面的发展，为人们作出高质量的分子诊断检测服务[2，3]。

1 常用的分子诊断技术

1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型，并在此基础上提出中心法则，描述遗传信息从基因到蛋白质的流动，标志着分子生物学作为一个独立学科的诞生。纵观分子诊断60年的发展历史，分子诊断学技术大致分为三大方面：分子杂交技术、基因扩增技术和基因测序技术。分子诊断学技术具有自动化、快速化、准确化等特点，在疾病的诊断、治疗、预后方面发挥越来越重要的作用[4]。

1.1 分子杂交技术分子杂交是指具有同源序列的两条核酸单链，在一定条件下按照碱基互补配对原则形成双链的过程。上世纪60年代开始，杂交技术得到迅猛的发展，能够通过已知基因序列的探针对靶序列进行捕获检测。主要技术有菌落原位杂交、斑点杂交、Southern印迹、Northern印迹、荧光原位杂交、芯片杂交等[2,4]。

原位杂交技术是利用碱基互补配对的原则，将靶基因在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。1975年Southern发明了DNA印迹技术，该方法利用DNA片段酶切和分子探针杂交技术，保证检测的特异性[5]。目前，Southern印迹法仍为探针杂交领域最经典的分子检测方法，在基因突变的检测方面广为应用。1977年Rudkin使用荧光素标记探针，发明了荧光原位杂交，使得原位杂交技术准确性更高，灵敏度更强[6]。原位杂交技术主要应用于基因定位、癌症基因检测和判断等方面。

1991年Affymetrix公司的Fordor研发了光蚀技术，制备了首个以玻片为载体的微阵列，标志着芯片技术正式成为可实际应用的分子生物学技术。基因芯片，又称DNA微阵列，是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列在载体表面，通过核酸杂交原理，用于检测DNA序列的新工具[7]。基因芯片技术具有高通量、高灵敏度、微型化、自动化等特点，在单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测、产前诊断、药物筛选等均有应用。

1.2 基因扩增技术1983年美国Cetus公司的Mullis发明了聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction,PCR)，该技术利用DNA高温变性和低温复性的原理，通过变性、复性和延伸3个温度变化，成功实现核酸片段的体外扩增。PCR技术以其特异性高、灵敏度高、简便、快速，对标本的纯度要求低等优点，被广泛应用到医学、农业、食品检验等领域[1]。

PCR技术分为两种：常规PCR技术和实时PCR技术。常规PCR技术，指仅对PCR扩增反应的终点产物进行定性或半定量分析，无法对起始模板准确定量，也无法对扩增反应实时检测的一项核酸扩增技术，但该技术所需技术平台和仪器设备较低，花费成本相对也低，目前临床上主要运用该平台对定性项目进行检测，例如：缺失基因、突变基因、融合基因等的检测。实时PCR技术，又称实时定量荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的技术。实时PCR技术，具有特异性强、准确度高、重复性好等特点，在检验医学上主要应用于核酸定量、mRNA表达水平分析等，可以分析和指导临床用药、监测药物疗效、判断病情进展[2]。

1.3 基因测序技术1977年Maxam提出了化学修饰降解法模型，为核酸测序时代的到来拉开序幕[8]。同年，Sanger等发明了DNA双脱氧链末端终止法，可以检测物种或细胞的核酸序列，再与基因库进行比对，从而知道被检测物种或细胞的特性。Sanger法作为最经典的测序方法，读取序列长，能够较好地处理重复序列和多聚体，仍为目前常用的测序方法，广泛应用于基因组DNA、cDNA等多重复序列的检测。该技术不足之处：灵敏度较低，通量较低。

1998年Ronaghi发明了焦磷酸测序法，其基本原理是利用引物延伸时所释放的焦磷酸基团激发荧光，通过峰值高低判断与其匹配的碱基数量[9，10]。比起Sanger法，提高了灵敏度，在SNP位点检测、等位基因突变测定等广泛运用。

近几年，发明了高通量测序技术，是对传统技术的一次革命性的创新。该技术通过DNA片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应，完成对海量数据的高通量测序。该技术测序速度快、准确度高，可以进行大规模的测序检测，主要应用于全基因组序列、内含子序列、外显子序列等的分析和研究[11]。

2 分子诊断学技术在检验医学中的应用

分子诊断就是应用分子生物学技术，在遗传物质的结构或表达水平，通过检测特定基因存在、转录及表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法。分子诊断学在检验医学中的应用，使越来越多的疾病的发生发展的分子机制得到阐明，为临床医生对疾病的诊断、治疗和预后，提供最为直接、最为准确的依据。目前分子诊断学技术在感染性疾病和遗传性疾病中的应用最为广泛。

2.1 分子诊断学技术在感染性疾病的应用感染性疾病是指外源病原体入侵机体后，生物体无法排除该病原体而产生一系列不适的反应。一般通过病原体培养或血清学方法进行病因查找。酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)是目前检验医学实验室检测免疫学指标应用最广泛的方法之一，广泛应用于乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋病等感染性疾病的诊断检测和诊断，具有灵敏度高、特异性强、快速简便等优点，但是一些影响因素不容小觑，临床待检标本常受溶血、黄疸、脂浊等因素的影响，导致检测结果判断错误[12]。血清学也只能确定机体是否接触病原体，不判断是否是现行感染。PCR和基因芯片技术应用于病原微生物的检测，具有敏感性高、耗时少、效率高等优点[3]。例如：利用实时荧光定量PCR技术检测乙肝病毒DNA的载量，与传统的酶联免疫法相比，既可以提示疾病的严重程度，也可以监测药物疗效、预后与复发。分子诊断学技术在感染性疾病的应用，可弥补血清学检测技术的缺陷，主要包括以下几个方面：(1)检查不能培养或生长缓慢的病原微生物；(2)通过病原微生物的定量检查监测病情；(3)微生物耐药性的检查；(4)细菌分型及流行病学调查。

2.2 分子诊断学技术在遗传性疾病中的应用遗传性疾病是指遗传因素占主要发病原因的某些疾病，几乎都存在一定的基因缺失或突变。分子诊断学技术是指通过分析患者体内遗传物质结构或表达水平的变化，对人体健康状态和疾病作出或辅助诊断的方法。分子诊断学技术已经能够诊断已知致病基因的遗传性疾病，对一些基因突变所致的遗传病也有良好的诊断意义，也能利用遗传标志来诊断一些病因未明的疾病[13]。例如，镰状细胞贫血：β-珠蛋白基因中第6位密码子的序列由原来的GAG改变为GTG，编码的血红蛋白为镰状细胞血红蛋白。通过PCR技术可以将包含突变位点的β-珠蛋白基因片段扩增，根据产物分析的结果可以对该遗传性疾病进行诊断。基于基因芯片技术，对基因SNP进行分型，检测遗传性耳聋基因，发现50%的儿童期耳聋与遗传因素有关[14]。采用序列特异性引物聚合酶反应(polymerase chain reaction with sequence specific primer,PCR-SSP)技术对白介素18基因启动子区-607C/A、-137G/C基因型多态性进行分析，从而发现该基因启动子区-607C/A、-137G/C多态性与江西人群哮喘未见相关性[15]。利用高通量测序技术，结合生物信息学，可以准确预测胎儿发生某些遗传性疾病的风险，从而达到降低畸形儿出生率的目的，例如：21-三体综合征(唐氏综合征)、18-三体综合征(爱德华综合征)等。

3 现状和挑战

分子诊断以PCR为基础，自从发明以来，广泛地应用于疾病诊断、疗效检测和预后判断，有力推动了检验医学的发展，开辟了检验医学的新领域，给检验医学带来机遇与挑战。在美国和欧洲等发达国家，分子诊断已经成为了医疗诊断不可或缺的重要组成部分，为人民的健康保驾护航发挥重要的作用。国内的分子诊断学技术在检验医学中的应用，虽取得一定程度的发展，但是始终落后临床的发展，难以满足临床诊断的要求，分子诊断项目开展较少，重视程度不够，应用缓慢[16，17]。以下从两方面分析我国分子诊断学技术应用于检验医学的现状及存在的问题。

3.1 分子诊断检测平台现在检验医学的发展方向是自动化和一体化，分子诊断学技术努力实现检测仪器、试剂和校准品的一体化，从而避免实验室之间结果的差异。我国的分子诊断在检验医学中的应用平台，还处在起步阶段，实现自动化尚需时日。目前我国在核酸提取、扩增反应系统准备、扩增前加样、上机、产物和结果分析等方面仍是以手工操作为主。欧美国家基本上采用自动化核酸提取系统，既可以提高工作效率，减少生物暴露时间，还避免操作人员个体差异对实验结果的影响，提高结果的可重复性和准确性。目前我国应用于检验医学的主流分子诊断学技术是实时荧光PCR技术，主要用于感染性疾病病原体核酸的检测，而欧美发达国家，检测平台较为多样，主流技术为测序，分子诊断涵盖了感染性疾病、遗传性疾病、肿瘤等领域。

3.2 技术人员的水平与能力分子诊断检验项目质量控制涵盖多个方面，包括分析前、分析中、分析后的各个层面，因此对技术人员、仪器、标本、环境要求更加严格。目前我国对分子诊断学技术人员的培训尚不到位，技术人员在实验操作、结果报告、临床咨询方面尚有很多不足之处。随着人们对人类基因组功能研究的深入，人们对生命、疾病、衰老、死亡的认识更深。分子诊断涉及个体的基因差异，要求相关技术人员能够提出专业的意见，指导预防疾病、降低患病风险，以及实现个性化治疗等，这就对从事分子诊断学技术的工作人员的水平和素质提出更高的要求。

4 前景和展望

在国际上，越来越多的分子诊断学技术应用于检验医学，国内检验医学界也越来越重视和发展分子诊断技术，并取得一定的成绩。但是，无论是分子诊断学技术在检验医学中的应用平台，还是从事分子诊断技术人员的能力，以及相关的管理规范，与国外先进技术或管理比较，都处在落后的局面。希望通过检验医学界同仁共同努力，规范管理分子诊断的开展，引进和培训分子诊断技术人员，缩短与国外先进水平的差距，为疾病的诊断、疗效检测和预后判断，作出高质量的分子诊断检测。

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Q52,R466

A

1674-1129(2014)06-0700-03

2014-07-09；

2014-08-27)

方炳雄，男，1985年2月出生，硕士学位，检验师，研究方向为临床分子诊断。