HPLC法测定不同产地赤芍中芍药苷的含量及重金属和残留农药的分析

陈 述

（中国中医科学院西苑医院药剂科，北京，100091）

中药研究

HPLC法测定不同产地赤芍中芍药苷的含量及重金属和残留农药的分析

陈 述

（中国中医科学院西苑医院药剂科，北京，100091）

目的：建立一种测定赤芍中芍药苷含量的高效液相色谱法，测定不同产地赤芍中芍药苷的含量并分析赤芍中重金属含量及农药的残留量。方法：色谱柱：Kromasil C18柱（5μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾（30∶70）；波长：230 nm；柱温：25℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10μL。采用原子吸收分光光度法对赤芍药材中的重金属铅、砷、铜、镉、汞进行分析，同时采用气相色谱法对有机氯类农药残留量进行测定。结果：芍药苷在0.1～1.0 mg/mL范围内，浓度与峰面积的线性关系良好（R2＝0.999 6），样品的平均加样回收率为98.8%，RSD为0.29%。17个不同产地的赤芍药材中芍药苷的含量为2.17%～4.17%；赤芍中检出铅、砷、铜、镉、汞的残留量分别为0.19～0.39、0.19～0.72、0.87～8.17、0.11～0.29和0.08～0.14mg/kg；部分赤芍药材中有检出有机氯类，DHC、DDT、PCNB的残留量分别为0.021～0.063、0.039～0.121和0.024～0.050 mg/kg。结论：17个产地的赤芍药材中芍药苷的含量均符合中国药典要求；药材存在一定量的重金属和有机氯类农药残留，除1份药材DDT含量超标外，其他药材的重金属及农药残留量均符合《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》中的限量规定，赤芍药材总体质量较好。

不同产地；赤芍；高效液相色谱法；芍药苷；重金属残留；农药残留

赤芍是由毛茛科植物芍药或者川赤芍的干燥根制成，是临床应用历史悠久、用量较大的著名野生中药材［1］，具有清血分实热［2］，散瘀血留滞的功能，主要是用于治疗瘀滞经闭［3］，腹胁疼痛，疝瘕积聚［4］，目赤肿痛等病症［5］。近年来，赤芍被广泛应用于治疗心血管类疾病，且具备抗肿瘤［6］、保肝［7］、抗内毒素、抑制胃酸分泌等药理作用［8］。赤芍中含有单萜苷、鞣质、三萜皂苷、儿茶素、芳香酸等多类化学成分［9］。目前研究多认为单萜苷类化合物（即赤芍总苷）是赤芍中的主要活性成分，赤芍总苷中主要包含芍药苷、苯甲酰芍药苷、羟基芍药苷、芍药内酯苷等化合物［10］，其中以芍药苷占赤芍总苷的75%以上［11］，是作为评价赤芍药材的质量优劣的指标性组分，由于土壤、水源、气候、种植施肥方式等环境因素的差异影响，不同产地赤芍药材中芍药苷的含量也因地域影响呈现差异，并且重金属及农药残留也呈现地域性的差异。

本文建立了一种测定赤芍药材中芍药苷含量的高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），测定17个不同产地赤芍药材中芍药苷的含量，并且根据药典方法对赤芍药材中重金属含量及有机氯类农药残留量进行测定分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 仪器与试药 高效液相色谱仪（Waters1525，配备四元泵及双波长紫外检测器）；电子天平AL204（梅特勒公司）；原子吸收光谱仪（1020MPT，长春吉大小天鹅公司）；气相色谱仪（Agilent 7890A）；芍药苷标准对照品及赤芍对照药材（中国药品生物制品检定所），其他不同产地药材为市售；重金属铅、砷、铜、镉、汞标准溶液（国家标准物质研究中心）；色谱纯乙腈、色谱纯甲醇（Fisher公司）；实验用水为二次蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 赤芍中芍药苷含量的测定

1.2.1.1 色谱条件 采用反相高效液相色谱法，Kromasil C18柱（5μm，4.6 mm×250 mm）；流动相采用甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾（30∶70）；UV检测器选择波长230 nm；柱温25℃；流速1.0 mL/min；进样量10 μL。理论塔板数以芍药苷峰计，不低于3 000。

1.2.1.2 对照品溶液的制备 先将芍药苷对照品置于含五氧化二磷减压干燥器中干燥36 h，待干燥完成后，准确称取100 mg芍药苷于50 m L容量瓶中，适量甲醇溶解后，继续用甲醇定容至刻度，即得浓度为2 mg/mL的对照品溶液。

1.2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取赤芍粗粉0.5 g置于具塞三角瓶中，加入甲醇35 m L，浸泡4 h后，超声30 min，冷却至室温后，经滤纸过滤于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻线，摇匀后经0.45μm滤膜过滤，按“1.2.1.1”项下色谱条件进样，分析。

1.2.1.4 标准曲线及线性范围 分别精密移取上述芍药苷对照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，5.0 mL，置于10 mL已标定的容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，获得浓度为0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/mL的系列标准溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，以浓度（X）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标作线性回归，得回归方程为Y＝1.458 9×107X+12 542（R2＝0.999 6）。结果表明，芍药苷在0.1～1.0 mg/m L范围内，浓度与峰面积的线性关系良好。

1.2.1.5 精密度 取上述芍药苷对照品溶液适量，配制成低、中、高（0.1、0.4、0.8 mg/mL）浓度的芍药苷对照品溶液，各平行配制5份，按“1.2.1.1”项下色谱条件进样分析，1 d内连续进样5次，连续测定3 d，测定其峰面积，计算峰面积的日内及日间RSD，结果日内RSD值为0.39%，日间RSD为1.02%。

1.2.1.6 重复性 准确称取赤芍粗粉末0.5 g，平行称取6份，按“1.2.1.3”项下方法制备供试品的溶液，并按“1.2.1.1”项下色谱条件进行分析，根据标准曲线计算芍药苷的含量。结果表明，样品中芍药苷的平均含量为4.17%，RSD为0.21%，说明本方法的重复性良好。

1.2.1.7 稳定性 取同一供试品溶液，在室温下放置0，2，4，8，10 h后，按“1.2.1.1”项下色谱条件进行分析，测定的不同时间点芍药苷的峰面积，并与0小时的峰面积相比较，结果不同时间点间的RSD值为0.89%，表明供试液在10 h内保持稳定。

1.2.1.8 加样回收率 准确称取已知含量的赤芍药材6份，平均分成3份，按照低、中、高3个水平分别准确加入一定量的标准品溶液，按“1.2.1.3”项下方法制备供试品溶液，并按“1.2.1.1”项下色谱条件进行分析，记录峰面积。

1.2.1.9 样品含量测定 选取17个产地的赤芍药材，粉碎后过3号筛，准确称取0.5 g制备好样品各三份。按“1.2.1.3”项下方法制备供试品溶液，制备完成后，按“1.2.1.1”项下色谱条件进行分析，记录峰面积。

1.2.2 重金属铅、砷、铜、镉、汞的测定 参照2010年《中华人民共和国药典》，采用原子吸收分光光度法对来自17个不同产地的赤芍药材中的重金属铅、砷、铜、镉、汞进行了测定。按照《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》中对于重金属元素的限量指标为：铅（Pb）≤5 mg/kg、砷（As）≤2.0 mg/kg，铜（Cu）≤20 mg/kg、镉（Cd）≤0.3 mg/kg、汞（Hg）≤0.2 mg/kg。

1.2.3 气相色谱法测定有机氯农药残留 参照《中华人民共和国药典》2000版一部附录IXQ有机氯农药残留量测定法，对来自17个不同产地的赤芍药材中有机氯类农药：六六六（BHC）、滴滴涕（DDT）、五氯硝基苯（PCNB）的残留量进行测定，测定结果见表4。按照《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》的限量规定：六六六（BHC）≤0.1 mg/kg、滴滴涕（DDT）≤0.1 mg/kg、五氯硝基苯（PCNB）≤0.1 mg/kg。

2 结果

2.1 根据标准曲线计算样品中芍药苷的含量 测得低、中、高浓度样品的平均回收率为98.8%，RSD为0.29%，具体结果见表1。

表1 HPLC-UV法测定赤芍中芍药苷含量的回收率（n＝6）

2.2 根据标准曲线计算样品中芍药苷的含量 色谱图如图1所示，测定结果见表2。

图1 标准对照品与样品的高效液相色谱图（芍药苷）

表2 不同产地赤芍中芍药苷含量测定结果

2.3 重金属铅、砷、铜、镉、汞的测定 测定结果见表3。2.4 气相色谱法测定有机氯农药残留 具体结果见表4。

3 结论

笔者建立了测定不同产地赤芍药材中芍药苷含量的HPLC方法，该方法线性良好，线性范围为0.1～1.0 mg/mL，平均加标回收率为98.8%，RSD为0.29%（n＝6），方法精密度及稳定性良好，方法测定17个不同产地的赤芍药材中芍药苷的含量为2.17%～4.17%，各产地的赤芍药材中含量有所差异，但均符合2010年《中华人民共和国药典》中赤芍药材中含芍药苷不得少于1.8%的规定。其中，以内蒙古扎兰屯所产的赤芍药材的中芍药苷含量最高为4.17%，

部分产地的赤芍药材检出重金属，赤芍中检出的铅、砷、铜、镉、汞的残留量分别为0.19～0.39 mg/kg、0.19～0.72 mg/kg、0.87～8.17 mg/kg、0.11～0.29 mg/kg、0.08～0.14 mg/kg；其中以铜元素检出率最高，17个产地中全部有检出，其他元素部分产地有检出，呈现地域差异，药材中重金属含量均符合《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》中的限量要求［12］。

表3 不同产地赤芍中重金属的测定结果

表4 不同产地中有机氯类农药的残留量（mg/kg）

农药残留是中药药材质量的重要控制方面，多地的赤芍药材检出有机氯类，DHC、DDT、PCNB的残留量分别为0.021～0.063 mg/kg、0.039～0.121 mg/kg、0.024～0.050 mg/kg，其中以DDT的检出率较高，17地中仅有黑龙江宝清所产的赤芍中DDT含量达到0.121 mg/kg，超过《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》中对于DDT≤0.1 mg/kg的限量要求，原因可能是主要是由于有机氯农药半衰期长，早期的大量使用导致土壤及水体中残留，导致该地区的中药材出现农药残留量超标现象［13］。

综上所述，赤芍药材的质量因产地不同而呈现地域性差异，测定芍药苷的含量及重金属、农药残留量，对于赤芍的内在质量的评价及其临床用药安全具有重要价值，本研究将为准确评价赤芍的质量提供参考和依据。

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（2014-02-07收稿 责任编辑：曹柏）

Analysis of Paeoniflorin，Residual Pesticide and Heavy M etal Content Determ ination in Radix Paeoniae Rub ra from Different Habitats by HPLC

Chen Shu
（Pharmacy Department of Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100091，China）

Objective：To establish a HPLCmethod to determine the content of paeoniflorin aswell as residual pesticide and heavymetal in Radix Paeoniae Rubra in different areas.Methods：Chromatographic column was Kromasil C18column（5μm，4.6mm×250mm）；mobile phase wasmethanol-0.05mol/L potassium dihydrogen phosphate（30：70）；wavelength was230 nm；column temperaturewas25℃；flow rate was1mL/min；sample size was10 L.Analysisofheavymetal lead，arsenic，copper，cadmium，mercury in Paeonia lactiflora were determined by atomic absorption spectrophotometry，and gas chromatography was used for the determination of organochlorine pesticide residues.Results：The contentof paeoniflorin was in the range of0.1 to1.0mg/mL，and the linear relationship between concentration and peak area（R2＝0.9996）were good.The average recovery was 98.8%，and RSD was 0.29%.The content of paeoniflorin in Radix Paeoniae Rubra from 17 differentareaswas2.17～4.17%；residues of arsenic，lead，copper，cadmium，mercury in Radix Paeoniae Rubra were 0.19～0.39，0.19～0.72，0.87～8.17，0.11～0.29 and 0.08～0.14mg/kg；part of Paeonia lactiflora found the detection of organochlorine residues，and DHC，DDT，PCNB were respectively 0.021～0.063，0.039～0.121 and 0.024～0.050mg/kg.Conclusion：The contents of paeoniflorin in Paeonia lactiflora in 17 areas were all in accord with the Chinese pharmacopoeial requirements；there is a certain amount ofmetalmaterials and organic chlorine pesticide residues inmedicinalmaterials，and except1 copy of DDT content exceeding the standard，the quantity are in line with the“medicinal plants and preparations of the green trade standard”in the provisions on limits of heavymetal and pesticide residue in othermedicinal herbs.The overall quality of Paeonia lactiflora is good.

Origin；Radix Paeoniae Rubra；HPLC；Paeoniflorin；Heavymetals；Pesticide residues

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.09.034