三仁汤对脾胃湿热证大鼠神经内分泌免疫功能影响的研究

洪 冰 李云鹏 武凯歌 马文校 钱益啸 罗 丹 文小敏

三仁汤对脾胃湿热证大鼠神经内分泌免疫功能影响的研究

洪 冰1李云鹏2武凯歌2马文校2钱益啸2罗 丹2文小敏2

目的探讨三仁汤对脾胃湿热证大鼠神经内分泌免疫功能相关指标的影响作用。方法将50只雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、三仁汤（高、中、低剂量）组，利用复合因素复制脾胃湿热证动物模型。通过称量法计算胸腺和脾脏指数，同时采用放射免疫法检测大鼠血浆促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、血清皮质醇（Cor）、白介素2（IL-2）的水平。结果造模成功后的各组大鼠血浆CRH、ACTH及血清Cor升高，三仁汤治疗组各剂量对其均有降低作用。造模后各模型组大鼠胸腺、脾脏指数及血清IL-2降低，三仁汤（高、中、低剂量）组可以升高模型组大鼠上述指标的水平（P <0.05）；且以上两种结果均以中剂量组效果最好。结论复合因素造模可以使脾胃湿热证大鼠神经内分泌免疫功能发生异常改变，三仁汤可以调节脾胃湿热证大鼠上述功能，这可能是清热祛湿的机理之一。

三仁汤；脾胃湿热证；神经内分泌免疫

脾胃湿热证是因感受湿热之邪，过食辛热肥甘，久之酿成湿热，内蕴脾胃而形成，岭南地区常见多发。该证临床症状复杂，病程较久，病势缠绵难愈，在脾胃湿热证的发生发展过程中，各种致病因素的刺激会使躯体做出应激反应，而导致神经内分泌免疫功能（Neuroendocrine Immune Functions,NEI）发生反应。三仁汤出自吴鞠通《温病条辨》，能宣上、畅中、渗下，具清利湿热、宣畅三焦气机之功，是用来治疗湿热初起的经典方[1]。本实验拟通过复合因素（外部湿热环境、肥甘饮食及微生物）造成脾胃湿热证大鼠模型，并探讨三仁汤对脾胃湿热证大鼠NEI相关指标的影响。

材料和方法

一、材料

1.三仁汤药物组成

参照《温病条辨》原组成比例，苦杏仁、法半夏各15 g，飞滑石、生薏苡仁各18 g，白通草、白蔻仁、淡竹叶、川厚朴各6 g。以上药物购自南方医院中药房。各药物在水中浸泡30 min，加水量约为药量8倍，煎煮3次，煎煮中用冷凝管收集蒸汽中挥发的药物成分，将3次药汁混合，离心取澄清药汁，依据《中药药理研究方法学》中人与大鼠剂量换算公式（大鼠按每只200 g体质量计算）[2]，浓缩配制成0.41、0.82、1.64 g/mL浓度药液，冰箱保存备用。

2.高糖高脂饲料

普通饲料中混入12%猪油，8%蜂蜜加工而成，由南方医科大学实验动物中心提供。

3.实验动物

SPF级雄性Wistar大鼠50只，购自南方医科大学实验动物中心，合格证号（SCXK（粤）2006-0015），体质量（200±20）g，随机分为5组，每组10只。

4.菌种及试剂

侵袭性大肠杆菌，浓度为109/mL，由南方医科大学微生物实验室提供。CRH、ACTH、Cor、IL-2放免试剂盒均购自北京普尔伟业生物科技有限公司。

5.实验仪器

AvantiTM230型超速冷冻离心机（美国BECKMAN公司）；PL303型电子天平（梅特勒托利多仪器<上海>有限公司）；SN-695型放射免疫r计数测量系统（上海核辅光电仪器有限公司）；南方医科大学公共卫生热带学院仿真模拟气候仓（可以调节温度、湿度、风速等）。

二、方法

1.动物分组

将50只SPF级雄性Wistar大鼠随机分成5组，分别为正常对照组、脾胃湿热证组、三仁汤（低剂量、中剂量、高剂量）组，每组10只。造模组动物均于造模前禁食12 h，自由饮水。

2.造模方法

①正常对照组：在温度20～28℃，相对湿度50%～60%的环境下，以普通混合饲料喂养。②脾胃湿热证大鼠模型：肥甘饮食饲料（在普通饲料中混入12%猪油，8%蜂蜜）喂养10 d。然后置于仿真模拟气候仓[环境设置为：温度（33±2）℃，相对湿度（75± 5）%，每天上午9时至11时]共8 d。第19天上午9时开始灌胃，按2 mL/200 g给予大肠杆菌1次，24 h后再加强感染1次（1 mL/200 g），移出置于自然环境，7 d后动物处死做相关检查。③三仁汤低剂量组（0.41 g/mL）：在脾胃湿热证大鼠模型的基础上，移出置于自然环境12 h后开始灌服三仁汤煎剂，2 mL/200 g，日1次，7 d后动物处死做相关检查。④三仁汤中剂量组（0.82 g/mL）：脾胃湿热证大鼠模型的基础上，移出置于自然环境12 h后开始灌服三仁汤煎剂，2 mL/200 g，日1次，7 d后动物处死做相关检查。⑤三仁汤高剂量组（1.64 g/mL）：脾胃湿热证大鼠模型的基础上，移出置于自然环境12 h后开始灌服三仁汤煎剂，2 mL/200 g，日1次，7 d后动物处死做相关检查。

3.标本采集及检测

大鼠处死前禁食12 h，用10%水合氯醛按0.7 mL/200 mg腹腔注射麻醉，迅速打开腹腔，①检测血浆CRH、ACTH：经腹主动脉采血2 mL注入加有EDTA和抑肽酶的采血管内，轻缓混匀，4℃3 000 r/min离心10 min，分离血浆，-20℃冰箱冻存待测；②检测血清Cor、IL-2：经腹主动脉采血2 mL注入普通采血管待凝固后，4℃3 000 rpm离心10 min，分离血清，-20℃冰箱冻存待测。③胸腺指数和脾脏指数：大鼠处死后，置于放有冰块的搪瓷盘中迅速剖开胸腔和腹腔，拭干，分别取胸腺、脾脏称重，分别计算与体质量之比，为胸腺和脾脏指数（mg/g）。

三、统计学处理

结果

一、症状和体征

造模前，所有大鼠表现正常，动作灵活，皮毛洁白光泽，摄食饮水正常，大便成形，体温正常。造模后，正常组无明显改变。模型组大鼠则随着造模时间的延长，大部分动物出现发热，倦怠，嗜卧懒动，反应迟钝，毛发蓬松，颜色枯槁；纳呆，不欲饮水，排便次数增多，从造模第10天开始，均出现大便溏泄或粘腻，体温升高较快，进入仿真气候仓后，大便溏泄或粘腻症状加重，渐见肛周污秽。三仁汤高、中、低剂量组灌服三仁汤后，活动逐渐增强，饮水、饮食量增加，大便渐渐恢复正常，体温恢复到正常水平。

二、各组大鼠血浆CRH、ACTH、血清COR含量测定结果

与正常对照组相比，模型组大鼠血浆CRH、ACTH、血清COR含量明显增高（P<0.01）；与模型组相比，三仁汤（高、中、低剂量）组大鼠血浆CRH、ACTH、血清Cor含量显著降低，有显著性差异（P< 0.01），尤以三仁汤中剂量组效果最好，其中对降低CRH，中剂量效果优于高低剂量，而降低ACTH，中剂量优于低剂量，但与高剂量无明显差别。而降低Cor，则中剂量优于高剂量，与低剂量无明显差别，见表1。

表1 各组大鼠血浆CRH、ACTH，血清Cor含量比较（x±s，pg/mL）

三、各组大鼠胸腺、脾脏指数、血清IL-2含量测定结果

与正常对照组比较，模型组大鼠胸腺、脾脏指数及血清IL-2明显降低，有显著性差异（P<0.05）。三仁汤（高、中、低剂量）对降低的胸腺、脾脏指数、血清IL-2均有升高作用，但只有中剂量改善效果差异具有统计学意义（P<0.05）。具体见表2。

表2 各组大鼠胸腺、脾脏指数、血清IL-2含量比较（x±s）

讨论

脾胃湿热证是临床常见和多发病证，《湿热病篇》指出：“太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，内外相引，故病湿热。”故“内外合邪”是湿热病证的发病特点。本课题组在国内脾胃湿热证动物模型的研究基础上，根据脾胃湿热证的发病特点，参考既往文献报道的造模方法[3-5]，以高糖高脂造成湿热内环境，以高温高湿模拟湿热外环境，结合生物致病因子（大肠杆菌作为致病外邪），以“内湿热+外湿热+生物致病因子”的复合造模方法模拟“内外合邪”，通过症状体征的观察及“经方反证”，成功复制脾胃湿热证大鼠模型。

在应激条件下，机体下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPA）会被激活，下丘脑接受来自高位中枢信息时，便合成和释放促肾上腺皮质激素释放激素（CRH），然后作用于垂体使其分泌促肾上腺皮质激素（ACTH），ACTH使肾上腺皮质分泌糖皮质激素（Cor），从而引起神经内分泌系统的紊乱[6-7]。有研究通过湿热环境加上小剂量致泻剂建立兔肠易激综合征（IBS）模型，发现ACTH等神经内分泌激素及其相关电解质有变化，表明神经体液内分泌系统参与了兔IBS的发生过程[8]。本研究通过外部湿热环境、病原微生物感染和肥甘饮食等复合因素造模，在各种致病因素的刺激下，结果显示造模后各模型组的症状体征与脾胃湿热证的临床常见的症候类似；经过经典方剂三仁汤治疗后，造模动物症候逐步恢复正常，也反证了模型所模拟的症候类似于脾胃湿热证临床所见的症候群，表明脾胃湿热证大鼠模型造模成功。并且从检测指标观察，血浆CRH、ACTH、血清Cor与对照组均有明显差别，显著升高，而经灌服三仁汤煎剂后，治疗组相关神经内分泌指标水平均降低，尤以中剂量组效果最好。表明三仁汤可以降低升高的CRH、ACTH、Cor，调节脾胃湿热证大鼠的神经内分泌功能。

神经内分泌及免疫系统间存在双向往返的反馈联系，神经内分泌的紊乱常影响免疫系统的改变[9]，胸腺和脾脏均为免疫器官，是淋巴细胞分化、成熟和产生免疫应答的场所，胸腺指数和脾脏指数是衡量集体免疫功能的重要指标。当机体免疫功能下降时，胸腺和脾脏常会出现质量变轻，功能下降[10-11]。IL-2是一种细胞因子，主要由活化的T淋巴细胞产生，是机体最主要、最强有力的T细胞生长因子。其水平高低是机体细胞免疫的重要标志之一，它可以促进个体细胞的增殖分化，增强NK细胞和T细胞活性，是免疫增强因子[12]。本研究发现与正常对照组比较，模型组胸腺和脾脏指数、IL-2明显降低，经三仁汤灌服干预后，三仁汤各治疗组均有升高，以中剂量组明显，这可能是由于复合造模因素下导致大鼠免疫功能受抑制所致。

本研究选择CRH、ACTH、Cor作为神经内分泌指标，IL-2、胸腺指数、脾脏指数作为免疫指标，通过研究发现脾胃湿热证大鼠的上述神经内分泌及免疫指标均有相应改变，提示脾胃湿热证的发生与神经内分泌免疫系统有关。通过三仁汤对脾胃湿热证干预，可以改善其上述指标，这可能是三仁汤清热祛湿作用的机理之一。

1李云鹏,文小敏,武凯歌,等.三仁汤对脾胃湿热证大鼠行为学及下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响.南方医科大学学报,2010,30(1): 126-128.

2陈奇.中药药理研究方法学.北京:人民卫生出版社,1993:1103.

3刘冬梅.健胃安中方对脾胃湿热大鼠胃黏膜环核苷酸含量的影响及组织病理学观察.中国中西医结合消化杂志,2001,9(3):160-161.

4吕冠华,劳绍贤.脾胃湿热证动物模型的建立与评价.广州中医药大学学报,2005,22(3):231-235.

5吕文亮,程方平,黄廷荣,等.燥湿运脾汤对脾胃湿热中阻证作用的实验研究.湖北中医杂志,2002,24(4):8-9.

6武春霞.运动和慢性应激对大鼠行为、免疫功能和神经内分泌的影响.太原:山西医科大学,2010:23.

7张曼,张丽萍,刘海鹏.应激的神经-内分泌-免疫网络机制及中医药干预研究进展.神经解剖学杂志，2008,24(2):215-217.

8赵泓舒,蔡月琴,潘永明,等.肠易激综合征模型WHBE兔神经-体液-内分泌系统调节的变化.中国比较医学杂志,2013,23(2): 26-31.

9李炜,刘培,段金廒,等.香附四物汤对气滞血瘀证雌性大鼠神经-内分泌-免疫网络的调控与影响.中国实验方剂学杂志,2014,20 (2):99-104.

10武凯歌,文小敏,洪冰,等.王氏连朴饮对脾胃湿热证大鼠血清IL-2、IL-6等的影响.江苏中医药,2010,42(5):71-72.

11汤小军,黄建春,梁韬,等.六月青皂苷对免疫抑制小鼠免疫功能的影响.中国免疫学杂志,2013,29(5):486-489,494.

12梁华，孙燕佩，朱明雪,等.四君子汤、四物汤对亚急性衰老模型雌性小鼠IL-2影响的实验研究.辽宁中医杂志,2013,40(2):193-194.

Effects of Sanren Decoction on neuroendocrine-immune functions of the spleen and stomach damp-heat syndrome in rats

HONG Bing1,LI Yun-peng2,WU Kai-ge2,MA Wen-xiao2,QIAN Yi-xiao2,LUO Dan2,WEN Xiao-min2.1）Hospital of Chinese Traditional and Western Medicine of Southern Medical University, Guangdong,Guangzhou 510315,China;2)School of TCM of Southern Medical University,Guangdong, Guangzhou 510515,China

Objective To study the effects of Sanren Decoction on neuroendocrine-immune function of the spleen and stomach damp-heat syndrome in rats.Methods Fifty male wistar rats were randomly divided into five groups:normal control group,model group,sanren decoction（low and medium and high dosage）groups.Thymus index and spleen index were calculated by quantified method.The levels of interleukin 2(IL-2),cortisol(Cort)in serum and adrenocorticotropic hormone(ACTH),corticotrophin releasing hormone (CRH)in plasma in different groups were detected by RIA.Results Compared with normal control group,the concentration of Cort in serum and ACTH,β-EP in plasma of the rats in the model group was significantly increased.The sanren decoction groups could reduce the levels of Cort in serum and ACTH,β-EP in plasma in different dosages(P<0.01 or P<0.05),especially the medium dosage had best outcome.Thymus index and spleen index and the concentration of IL-2 in serum of the rats in the model group was significantly decreased. Conclusion To establish the model of the spleen and stomach damp-heat syndrome in rats by complex factors can change neuroendocrine-immune functions.Sanren decotion can effctively adjust the functions of rats′neuroendcrine-immune,which may be one of the mechanism of clearing heat and expelling damp of Sanren Decotion.

Sanren Decoction;spleen and stomach damp-heat syndrome;NEI

2014-05-10）

（本文编辑：肖冰）

10.3961/j.issn.1672-2159.2014.03.003

1 510315南方医科大学中西医结合医院；2 510515南方医科大学中医药学院

文小敏，Email：wxm@fimmu.com

广东省中医药局科研基金（2008195）；广东省中医药管理局课题（20131242）；南方医科大学中西医结合医院院长基金（2201301002）