雷公藤药材中雷公藤甲素及总二萜内酯的含量测定※

马鑫斌 巴文强 王 玎 王利胜*

（1广州中医药大学中药学院，广州510006；2华南农业大学医院，广州510642）

雷公藤药材中雷公藤甲素及总二萜内酯的含量测定※

马鑫斌1，2巴文强1王 玎1王利胜1*

（1广州中医药大学中药学院，广州510006；2华南农业大学医院，广州510642）

目的建立雷公藤药材中雷公藤甲素及总二萜内酯含量测定的方法。方法采用高效液相色谱法，色谱柱：Platisil ODS柱（250mm×4.6mm，5μm），以甲醇-水（45∶55）为流动相进行洗脱，于218nm波长处检测，测定雷公藤甲素的含量；采用Kedde显色法，在550nm波长处测定吸光度，测定总二萜内酯的含量。结果以高效液相色谱法测定雷公藤甲素，在0.58～46.40μg·mL-1（r＝0.9999）范围内线性关系良好，平均回收率为100.52%（n＝6）；比色法测定雷公藤总二萜内酯（以雷公藤甲素计）在0.49-39.36μg·mL-1（r＝0.9999）范围内线性关系良好，平均回收率为93.28%（n＝6）；雷公藤药材中雷公藤甲素平均含量为4.20μg· g-1，总二萜内酯为86.64μg·g-1。结论本实验所建立的方法稳定，精密度良好，适合于雷公藤甲素及总二萜内酯的含量测定，可用于雷公藤药材的质量控制。

雷公藤甲素；总二萜内酯；高效液相色谱法；显色法

雷公藤为卫茅科植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook．F．）的根，又名黄藤木、断肠草、红药等，具有抗炎、抗菌、免疫调节等多种药理作用［1-2］。自20世纪60年代应用于治疗类风湿关节炎（RA），雷公藤以其见效快、疗效确切而被推荐为治疗RA的首选药物。雷公藤主要含有雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤碱、雷公藤次碱等，此外还含三萜类、倍半萜类及卫矛醇、卫矛碱等，其中二萜类和生物碱类是主要活性成分［3-4］，而且一种成分往往具有多方面，不同成分又具有相近的药理活性，这些活性成分同时也是毒性成分［5-6］。目前，大多数对于雷公藤药材的质量评价主要是对雷公藤甲素进行含量测定，然而单一的化学成分不能完全反映出药材的质量，因此本研究再增加总二萜内酯大类成分进行质量控制。本文分别以HPLC和比色法对雷公藤甲素和总二萜内酯进行含量测定，从单个有效成分和有效成分总类对雷公藤药材质量进行分析，所建立的方法稳定可靠，可为雷公藤药材质量控制提供科学依据。

1 实验材料

1.1实验仪器KQ5200DE型数控超声清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司），AUW120电子分析天平（日本岛津），ELB200电子天平（日本岛津），SKM型数显恒温电热套（山东鄄城光明仪器有限公司），Waters高效液相色谱仪（2487紫外检测器，515泵，美国Waters公司），N3000色谱工作站（浙江大学），UV-2450型紫外可见分光光度计。

1.2药品与试剂雷公藤甲素对照品（批号：111567-200502，购于中国药品生物制品检定所），甲醇为色谱纯，水为纯水，中性氧化铝（100-200目，上海五四化学试剂有限公司），3，5-二硝基苯甲酸（阿拉丁，批号：39575），其余试剂均为分析纯。

雷公藤药材购于安国市冷背药材有限公司（产自河南），经广州中医药大学李薇教授鉴定为卫矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.F.的根。

2 方法与结果

2.1高效液相色谱法测定雷公藤甲素的含量

2.1.1对照品贮备液的配制精密称取干燥至恒重的雷公藤甲素对照品适量，置25mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度即得浓度为0.058mg·mL-1的对照品贮备液。

2.1.2供试品溶液的制备取雷公藤药材粉末5g（过3号筛），精密称定，加入95%乙醇溶液100mL回流提取3次（3，2，2h），过滤，合并滤液，水浴挥干乙醇至适量。称取中性氧化铝8g，湿法装柱（内径1.0cm），样品上柱，用30mL乙酸乙酯洗脱，洗脱液浓缩至干，残留物用适量无水乙醇溶解并转移至5mL容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.1.4色谱条件及系统适用性试验色谱柱：Platisil ODS柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相：甲醇-水（45∶55），检测波长：218nm，柱温：室温，流速：1.0mL ·min-1，进样量：20μL。在上述色谱条件下，雷公藤甲素与相邻峰的分离度大于1.5，理论塔板数以雷公藤甲素计大于3000。雷公藤甲素对照品，样品及空白对照色谱图，见图1。

图1 雷公藤甲素的HPLC色谱图

2.1.5线性关系考察精密吸取雷公藤甲素对照品贮备液0.05、0.25、0.5、0.75、1、2、4mL置5mL容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，配制成不同浓度的对照品溶液。用“2.1.4”项下色谱条件进行分析。以雷公藤甲素对照品溶液浓度X（μg·mL-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。得到线性回归方程Y＝45186.8X-11192.8，r＝0.9999（n＝7），表明雷公藤甲素在0.58-46.40μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.1.6精密度试验精密吸取对照品溶液20μL，连续进样6次，测定，计算得峰面积RSD为1.10%，表明仪器的精密度良好。

2.1.7稳定性试验精密吸取同一份供试品溶液20μL，分别于制备好后1、2、4、6、8、12h进样一次，测定，结果表明供试品溶液在12h内稳定，其峰面积RSD为0.80%。

2.1.8重现性试验取同一批雷公藤药材粉末5g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备成6份供试品溶液，取各供试品溶液20μL，按“2.1.4”项下色谱条件进行测定，得其峰面积RSD为1.91%，表明重现性良好。

2.1.9加样回收试验精密称取已知含量的雷公藤粉末2.5g，共6份，精密加入一定量的雷公藤甲素对照品贮备液，挥干。照“2.1.2”项下制备供试品溶液，按“2.1.4”项下色谱条件进行测定雷公藤甲素峰面积，计算平均回收率为100.52%，RSD为2.28%（n＝6）。

2.1.10样品测定称取同一批雷公藤粉末5g，共3份，精密称定，照“2.1.2”项下制备样品溶液，各精密吸取20μL进样测定雷公藤甲素的含量，结果见表1。

在平时积极学习应急预案，落实各项预防及抢救准备工作；定期请从事急性中毒研究方面的专家，为相关医护人员讲课，使其不断提高有关中毒药品、危害性、处理方法的理论水平；另外，亦应制定突发性职业中毒危机处理方案，并开展学习，掌握危机处理方案中的具体方法，确保能够在急救护理工作中熟练运用；最后，平时应做好抢救演练工作，提高应急能力，有利于促进抢救效率的提高[3] 。

表1 含量测定结果

2.2紫外可见分光光度法测定雷公藤总二萜内酯的含量［7-10］。

2.2.1对照品贮备液的制备精密称取雷公藤对照品0.00123g，置25mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2显色剂的配制2%3，5-二硝基苯甲酸溶液：称取3，5-二硝基苯甲酸2g，加无水乙醇溶解成100mL即得。2%氢氧化钾溶液：称取氢氧化钾2g，加纯水溶解成100mL即得，临用前1：1混合。

2.2.3供试品溶液的制备精密吸取“2.1.2”项下供试品溶液1mL，置5mL容量瓶中，无水乙醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.4检测波长的选择精密吸取雷公藤甲素对照品贮备液和供试品溶液各2mL，置10mL试管中，在冰水浴中精密加入2mL的2%3，5-二硝基苯甲酸溶液和2mL的2%氢氧化钾溶液，摇匀，冰水浴中放置10min，取出，用自来水冲洗管壁2min，摇匀，以2mL的无水乙醇加2mL的2%3，5-二硝基苯甲酸溶液和2mL的2%氢氧化钾溶液为参比，在400～800nm波长范围内扫描，结果表明对照品贮备液和供试品溶液的最大吸收峰在550nm波长处，故选550nm为测定波长。

2.2.5线性关系考察精密吸取雷公藤甲素对照品贮备液0.05、0.25、0.5、0.75、1、2、4mL置5mL容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，配制成不同浓度的对照品溶液。各精密吸取2mL在550nm处测定吸光度，操作方法同“2.2.4”项下，以吸光度A为纵坐标，浓度C（μg· mL-1）为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程为A＝0.0122C＋0.0002，r＝0.9999（n＝7），表明雷公藤总二萜内酯（以雷公藤甲素计）在0.49～39.36μg·m L-1范围内线性关系良好。

2.2.6精密度试验精密吸取雷公藤甲素对照品溶液2mL，按“2.2.4”项下操作，连续重复测定6次，计算其RSD值为0.20%，表明仪器的精密度良好。

2.2.7稳定性试验精密吸取供试品溶液2mL，按“2.2.4”项下操作，于制备好后1h内测定吸光度（每隔5min），考察1h内供试品溶液显色稳定性，结果表明0～20min内吸光度稳定（RSD＝2.48%，n＝5）。

2.2.8重现性试验取“2.1.8”项下供试品溶液按“2.2.3”项下制备供试品溶液，按“2.2.4”项下操作，测定其吸光度，计算得其RSD值为1.82%（n＝6）。

2.2.9加样回收试验取已知含量的雷公藤药材粉末2.5g，共6份，精密称定，各样品中加入与供试品等量的雷公藤甲素对照品贮备液，挥干，按“2.1.2”项下制备供试品溶液，按“2.2.4”项下操作，测定其吸光度，代入标准曲线，计算平均加样回收率为93.28%，RSD为1.72%（n＝6）。

2.2.10样品含量测定取“2.1.10”项下各样品溶液，按“2.2.3”项下制备样品溶液，照“2.2.4”项下操作，测定其吸光度，代入标准曲线计算雷公藤总二萜内酯的含量，结果见表1。

3 讨论

3.1提取条件的考察本研究对超声和回流两种提取条件进行了考察，结果经过超声处理测得雷公藤甲素平均含量为1.49μg·g-1（RSD＝1.97%，n＝3），总二萜内酯为38.75μg·g-1（RSD＝1.54%，n＝3），而进行回流处理测得的雷公藤甲素平均含量为1.92μg·g-1（RSD＝2.87%，n＝3），总二萜内酯为42.51μg·g-1（RSD＝2.32%，n＝3），因此本实验选择回流作为提取条件。

3.2提取溶剂的选择本研究考察了甲醇、乙醇、乙酸乙酯的回流提取，结果乙醇的提取效率较高，较完全，故选择乙醇作为本实验的提取溶剂。经过甲醇提取测得的雷公藤甲素平均含量为1.32μg·g-1（RSD＝2.04%，n＝3），总二萜内酯为40.49μg·g-1（RSD＝1.13%，n＝3），经过乙醇提取测得的雷公藤甲素平均含量为2.43μg ·g-1（RSD＝2.58%，n＝3），总二萜内酯为46.43μg· g-1（RSD＝1.13%，n＝3），经过乙酸乙酯提取测得的雷公藤甲素平均含量为1.70μg·g-1（RSD＝1.93%，n＝3），总二萜内酯为37.56μg·g-1（RSD＝2.66%，n＝3）。

3.3中性氧化铝与洗脱液用量的考察使用中性氧化铝可吸附色素及极性物质，本实验对中性氧化铝用量进行了考察，发现8g的用量能够较好地分离和洗脱雷公藤甲素出来，极大地消除了色素的干扰。本研究选择乙酸乙酯作为洗脱液［11-12］，洗脱液用量考察发现，洗脱液的用量对雷公藤甲素和总二萜内酯的含量并没有太大的影响，故选择洗脱液体积30mL进行洗脱。

3.4流动相的考察流动相为甲醇-水体系，比例为40∶60时，保留时间大约为23min，但有杂质峰的影响，出现重叠峰，反复调整流动相比例，当比例为45∶55时能够较好的分离，峰形较好。

雷公藤药材中有效成分较多，其中雷公藤甲素和总二萜内酯是主要的有效成分，是雷公藤药材质量控制的重要检测指标，本研究分别建立的两种检测方法简单可行，能够制备一份供试品同时检测出二者含量。雷公藤药材的作用主要是通过多组分的协调作用而起疗效的，仅靠单一含量测定指标对质控作用的局限性较大，应选择多个质控指标并建立含量测定方法，构建多指标含量测定体系，以期进一步提高药材质量标准水平和质量控制的水平，保证雷公藤药材用药的安全与有效。

［1］马伟光，张滔，张超，等．有毒药物雷公藤的研究及展望［J］．中华中医药杂志，2006，21（2）：117-120．

［2］饶毅，魏惠珍，陈银芳，等．中药配伍应用于雷公藤减毒增效的研究进展［J］．中国中药杂志，2008，33（14）：1658-1661．

［3］徐央丽．雷公藤的研究进展［J］．现代中西医结合杂志，2008，17（12）：1941-1942．

［4］杨芳．雷公藤的研究进展［J］．第一军医大学分校学报，2003，26（2）：159-160．

［5］薛璟，贾晓斌．雷公藤化学成分及其毒性研究进展［J］．中华中医药杂志，2010，25（5）：726-733．

［6］刘为萍，刘素香．雷公藤研究新进展［J］．中草药，2010，41（7）：1215-1218．

［7］庄莹，宋敏，杭太俊，等．雷公藤片剂中雷公藤总内酯及雷公藤甲素的测定［J］．药物分析杂志，2008，28（1）：36-40．

［8］张一萍，喻丽元．雷公藤提取物中的内酯类成分分析［J］．中国现代药物应用，2007，1（8）：6-7．

［9］施栋磊，朱华旭，潘林梅，等．雷公藤药材中有效部位含量的比较研究［J］．中药新药与临床药理，2009，20（6）：566-570．

［10］高丽，聂中标，尚彩玲，等．不同产地雷公藤药材中总二萜内酯含量的测定［J］．山西中医学院学报，2011，12（4）：11-13．

［11］任江剑，徐建中，余绍海，等．采收时间和根直径对雷公藤中雷公藤甲素含量的影响［J］．中药材，2011，34（4）：520-522．

［12］高丽，聂中标，岳晓华，等．不同产地雷公藤药材中雷公藤甲素含量测定［J］．山西中医，2012，28（8）：42-44．

菊花为枕 明目安神

菊花枕在医籍中早有记载，《本草纲目》即有菊花＂作枕明目＂之说。单就菊花枕而言，又有黄菊花和白菊花之分。黄菊花枕可防风热外感，白菊花枕可养肝明目。菊花与绿豆皮、黑豆皮为伍，前者清热之功更增；后者则以清肝明目见长，是防治肝阳上亢之头昏目眩及诸目疾之良方。

菊花通窍枕黄菊花300g，白芷、辛夷各150g，装入枕芯。黄菊花清热疏风。王安石《字说》云：“芷香可养鼻，又可养体”；《本草纲目》说：“白芷疗风通用，其气芳香，能通九窍。”辛夷亦可解表疏风通鼻窍。故此枕可治鼻塞不通、不闻香臭、流涕腥臭、头痛、眉棱骨痛之鼻渊证，对头风眩晕、风火牙痛，亦有良效。

菊花明目枕黄白菊花各150g，配苦荞麦皮200g，黑豆皮100g，决明子300g，同装入枕芯中。此枕养阴清热，对肝阴不足、肝火上炎而致的目赤肿痛、干涩羞明、视物不清等症，均有良好疗效。

——中国中医药报

Dedtermination the Content of Triptolide and Total Diterpene Lactones in Tripterygium Wilfordii Hook.F．

Ma Xinbin1,2Ba Wenqiang1Wang D ing1Wang Lisheng1✫
（1 School of Chinese Herbal Medicine,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China；2 Hospital of South China Agriculture University,Guangzhou 510642,China）

ObjectiveTo develop methods for the determination of total diterpene lactones and triptolide in Tripterygium wilfordii Hook.F.MethodsThe HPLC analysis for triptolide was carried on an Platisil ODS column（250mm×4.6mm，5μm），to the methanol：water（45：55）as mobile phase elution and UV detection at 218nm，determine the content of triptolide．A colorimetric method was established for the assay of the total diterpene lactones with 3，5-dinitrobenzoic acid as the coloring reagent and measuring of the absorbance at 550nm．ResultsThe calibration curves were linear in the ranges from 0.58～46.40μg·mL－1（r＝0.9999）for triptolide with HPLC and from 0.49～39.36μg·mL－1（r＝0.9999）for the total diterpene lactones（caculated as triptolide）with colorimetric method．The average recoveries（n＝6）were 100.52%and 93.28%，respectively．The average content of triptolide in Tripterygium wilfordii Hook．F．is 4.20μg·g－1，total diterpene lactones is 86.64μg·g-1．ConclusionThe method is in good reproducibility，precision and stability and is fit to determine the total diterpene lactones and triptolide in Tripterygium wilfordii Hook．F．At the same time，they can be used for the assay and quality control of the Tripterygium wilfordii Hook．F．

Triptolide；Total diterpene lactones；HPLC；Colorimetric method

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.06.097

：1672-2779（2014）-06-0153-03

苏 玲 本文校对：刘 冰

2013-12-28）

教育部产学研结合项目［No：2012B091100486］

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