直接扩增技术在接触性检材DNA检验中的应用

李长征 刘海东 崔 文 寻超群 孙贤学 姜铭章

(1济宁市公安局刑侦支队,山东 济宁 272000；2济宁医学院法医学与检验医学学院，济宁 272067)

案件现场接触性检材DNA的检验一直是难题，传统的DNA提取方法无论是chelex-100提取法、磁珠法还是硅珠法对目标载体的选择都为大载体，虽然可以保证获取到足够的DNA模板，但大体系的提取方法也降低了目标DNA的单位浓度，从而造成扩增结果的失败。极微量的接触性DNA检材如果选取大载体进行提取更容易获得混合DNA分型。直接扩增技术是使扩增直接从检材开始，对接触性DNA检材的检验较传统提取方法有着明显优势[1]，其对目标载体的选择更有针对性，在保证获得足够模板DNA的同时，更容易得到单一个体来源的DNA分型。本文采用DNA直接扩增技术对案件现场中的不同生物检材DNA进行直接扩增，以探讨该技术的有效性，为保证结果的可靠性和可重复性，我们采取了在载体的一定面积内选取多个点进行平行扩增的方法。

1 材料与方法

1.1 检材

120份检材全部来自本实验室日常受理案件中的现场生物检材。包括手套20只，烟蒂20枚，上衣20件，饮料瓶、吸管20个，残缺指纹40枚。分别剪取3处2mm×2mm手套拇指虎口或手背浮出的纤维、3处2mm×2mm烟蒂与口唇接触处外面纸片、3处3mm×3mm上衣袖口或衣领处5cm×5cm面积内布片、3处2mm×2mm擦拭饮料瓶口和吸管的擦拭棉签、3处大小为2mm×2mm残缺指纹擦拭湿棉签。

1.2 仪器与试剂

ABI 9700 PCR仪和ABI 3500xL测序仪(美国ABI公司)；Identifiler Direct试剂盒(美国ABI公司)； Identifiler扩增试剂盒(美国ABI公司)；5% chelex-100饱和溶液；10mg/ml，蛋白酶K(proteinose K,PK)；QIAGEN硅膜试剂盒。

1.3 PCR扩增及产物检测

将上述样品采用Identifiler Direct PCR试剂盒进行直接扩增，操作按试剂盒说明进行，扩增体系12.5μl。将扩增产物在ABI 3500xL遗传分析仪上进行电泳，电泳结果采用GeneMapper ID-X基因分析软件分析。

另取上述相同样品，分别采用QIAGEN硅膜和chelex-100提取法提取DNA，采用Identifiler试剂盒进行扩增，操作按推荐参数进行，扩增体系10μl。电泳及分析方法与上述相同。

2 结果

2.1 直接扩增法与QIAGEN硅膜和chelex-100提取法比较

50份检材分别采用直接扩增、chelex-100法和QIAGEN硅膜法提取DNA后扩增并进行分型检验，以15个STR基因座及Amelogenin全部检出为检验成功，检出9个以上的STR基因座及Amelogenin为有效。

检验结果显示，同一检材用3种方法检测，分型结果并不相同，如在手套检材的检测中，直接扩增法检出的基因型均为单一个体来源，而QIAGEN硅膜及chelex-100法提取到2个获取混合型。因此从图1-3可以看出，相对于常规提取方法，直接扩增发更易于获得单一个体来源的DNA分型，其检验结果具有更高的有效性。见图1～3。

图1 直接扩增法检测手套DNA分型图谱

图2 QIAGEN硅膜提取手套检材DNA分型图谱

图3 chelex-100法提取手套检材DNA分型图谱

2.2 各种生物检材成功率

直接扩增法对手套检材的成功率为90%，对烟蒂、衣服、饮料瓶和吸管、残缺指纹的成功率分别为100%、70%、90%和60%，平均成功率达到70%以上。而相应检材QIAGEN硅膜成功率分别为50%、80%、60%、70%，30%；chelex-100成功率为50%、70%、40%、60%，10%。从表1中可以看出，直接扩增技术对不同接触性生物检材DNA检验成功率也高于常规提取方法。见表1。

表1 各种检材的检验成功率(n，%)

2.3 直接扩增法平行检验检材接触性DNA的可重复性

对5种检材一定面积内多处取点，采用直接扩增法平行扩增，结果表明，虽然不同类别的接触性生物检材在成功率上略有不同，但有效分型的结果相同，说明检材不同位置取点均可保证实验结果的可靠性和可重复性。每个检材不同部位检出有效率基本相同，其成功率可能与DNA在各个取点上存在的量有差异有关。除1例手套检材的3个点位出现了2种不同分型外(可能与日常生活中混戴手套有关)，其余检材的多部位取点扩增结果均为同一分型。见表2。

表2 直接扩增法平行扩增各种检材结果(n，%)

3 讨论

直接扩增试剂盒自研发投入实验室应用以来，一直用于违法人员数据库的建设。检材均为单一个体来源，FTA卡或滤纸提取，检验中省略了提取过程，大大节省了建库的成本，提高了检验效率。一直以来，由于受到常规DNA检验观念的影响，认为这种免提取的直接扩增试剂盒只能应用于FTA卡提取的血液检材，而未将其作用进一步的开发。本实验室在日常检案中，最先将直接扩增试剂盒和直接扩增方法应用到除血卡、血滤纸以外的其他单一个体来源的DNA检材，如口腔拭子、毛发、肋软骨、肌肉组织等，发现效果十分理想。这一应用在很大程度上解决了提取过程中繁琐的操作步骤，大大减轻了工作的强度。

本文中将直接扩增试剂盒应用到案件现场接触性检材的DNA分析，发现直接扩增法检验接触性DNA成功率明显高于QIAGEN硅膜和chelex-100法。其主要原因是由于直接扩增法对剪取的适量接触性检材不需要再加入其它试剂即可直接扩增，单位体系DNA浓度较高；而采用常规QIAGEN硅膜、chelex-100法提取DNA，在提取环节中加入的各种提取试剂使本来就微量的检材DNA被进一步被稀释，降低了DNA模板浓度。对于常量DNA检材不影响检验结果，而对于接触性微量检材，稀释环节就有可能使DNA模板浓度达不到检出的阈值，从而降低了检出率[2]。

本文结果显示，直接扩增法相对于QIAGEN硅膜和chelex-100法提取法更易于获得单一个体来源的DNA分型，使检验结果具有更高的有效性。分析原因为直接扩增法剪取检材面积较小，有利于获得单一个体的脱落细胞； QIAGEN硅膜和chelex-100提取法，由于需要检材量较大，大面积的取材则较容易提取到多人遗留的脱落细胞。

本文将案件现场接触性检材采用一定面积内多处取点进行平行扩增，可以保证实验结果的可靠性和可重复性。对检材进行小面积的取点，更容易获得单一的DNA分型，同时也容易“取不到”目标DNA，或者恰好取到“无关DNA”，造成结果的失败或偏差。多处取点，平行扩增可以有效地保证结果的可靠性和可重复性，从而取得较高的成功率。

综上所述，将直接扩增技术应用到现场案件不同接触性生物检材，创新了一套针对接触性DNA检材的直扩方法，多点取材、平行扩增、分类提取等直接扩增技术，为疑难生物检材的检验应用提供了可靠的解决方案。

[1] 张艳霞，李爱强，赵丽.直接扩增法用于现场检材DNA检验[J].中国法医学杂志，2012，27(1)：62-63.

[2] 李林，刘静，王敏.直接扩增法在血痕、肋软骨和唾液检材中的应用[J].中国法医学杂志，2013，28(2)：148-149.