pB2R-Venus重组真核载体的构建及在HEK293T细胞中的表达*

季丙元 程葆华 王春梅 陈 京△ 白 波△

(1济宁医学院神经生物学研究所,山东 济宁 272067；2山东农业大学生命科学学院,山东 泰安 272018)

激肽是重要的促炎症多肽，由激肽释放酶作用于激肽原产生，酶解产物缓激肽和胰激肽主要通过缓激肽2型受体(bradykinin receptor 2,B2R)起作用。B2R是一种G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors，GPCRs)，能调节心血管平衡、增加血管通透性[1]和NO的释放[2]，同时还能促进炎症反应和伤害性效应，B2R目前已成为重要的药物靶标。近年来，有关GPCR二聚化或寡聚化的研究日益增多[3-4]，本实验构建的pB2R-Venus真核表达载体可通过生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer，BRET)、荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)或双分子荧光互补等研究技术发挥作用，用来研究BDKRB2同其他受体或蛋白间的相互作用，也可用于研究受体的脱敏、内化、泛素化等过程，阐明受体作用的机制，从而有助于进一步探讨其作为药物靶标的潜力。

1 材料与方法

1.1 材料

含人B2R全长cDNA基因序列的重组载体pcDNA3.1-B2R和含Venus编码序列的重组载体(Clontech公司)。DNA聚合酶、T4 DNA连接酶和限制性核酸内切酶均购自Fermentas公司，PCR产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶胶回收试剂盒及无内毒素质粒大提及小提试剂盒均购自北京天根生物有限公司；HEK293T细胞系为实验室保存；DMEM培养基购自Gibco公司，转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。引物由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1目的基因的获取及引物设计 登录Genebank获取人BDKRB2(B2R) cDNA序列(AY275465)，根据B2R序列特点和pVenus-N1的序列特点设计引物，并在引物末端引入酶切位点。由引物设计软件Primer5.0设计出引物，正向引物序列为：5’-CCCGAATTCACCATGTTCTCTCCCTGGAAGATATCA-3’(含EcoRⅠ酶切位点)，反向引物序列为：5’-CGCGGATCCGCCTGTCTGCTCCCTGCCCAGTC-3’(含BamHⅠ酶切位点)。

1.2.2重组真核表达载体pB2R-Venus的构建 以pcDNA3.1-BDKRB2为模板进行PCR反应，反应体系总体积为50μl，其中模板2μl，上下游引物各1μl，2×EasyTaq superMix 25μl，余则用超纯水补足。反应条件：95℃ 预变性1min，然后95℃ 45s，65℃ 45s，72℃ 90s，共32个循环，然后72℃延伸10min，琼脂糖凝胶电泳，获得约1.2Kb大小的目的片段，胶回收试剂盒回收PCR产物。限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切PCR产物和表达载体pVenus-N1。酶切后的PCR产物和pVenus-N1电泳、胶回收，T4DNA连接酶室温连接4h。连接产物转化至大肠杆菌DH5α，37℃ LB培养基培养过夜，挑取单克隆，摇菌过夜，质粒提取后用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定构建结果是否正确。将酶切正确的质粒送上海生工公司测序。

1.2.3细胞转染 HEK293T细胞常规(37℃，5%CO2，10%胎牛血清)培养、传代。将状态良好的、处于对数生长期的细胞按1×106个 /孔接种至6孔板中，待细胞长至90%融合时，将培养基换成不含血清的DMEM培养基，转染重组质粒。实验分为两组：对照组(仅转染对照质粒pVenus-N1)和转染组(转染重组质粒pB2R-Venus)，具体转染方法参照转染试剂说明书进行。转染后6 h，换成新鲜的含10%血清的DMEM培养基，继续培养。

1.2.4pB2R-Venus重组表达载体在HEK293T细胞中的表达检测 1)荧光显微镜:转染后36 h，将培养有转染质粒细胞的6孔培养板直接放在显微镜下观察。2)Western blot:转染后 48 h,收集各组细胞，加入适量RIPA裂解液，置冰上裂解30 min，其他按常规方法操作[5]。提取后的蛋白，进行Western blot检测。抗B2R一抗按1∶1000 稀释，β-actin小鼠单克隆抗体作内参，1∶1000稀释。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG 作二抗，1∶5000稀释，ECL化学发光显影。

2 结果

2.1 pB2R-Venus重组质粒的构建

以pcDNA3.1-B2R为模板，经PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示，扩增产物长度为1176 bp，与人B2R基因长度相等。见图1。重组表达载体pB2R-Venus经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，电泳结果显示重组质粒被切成长度较大的载体片段和长度约为1200 bp的DNA片段，初步说明质粒构建正确。见图2。重组质粒pB2R-Venus测序图谱和序列结果显示，重组质粒序列与人B2R全长cDNA完全一致，说明质粒构建正确。见图3。

图1 PCR扩增人B2R基因片段

图2 重组质粒pB2R-Venus被EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切

图3 重组质粒pBDKRB2-Venus测序图谱

2.2 荧光显微镜检测重组质粒在HEK293T细胞中的表达

荧光显微镜观察重组质粒pB2R-Venus在HEK293T细胞中的表达情况，结果表明，对照组细胞，即只转染表达质粒pVenus-N1的细胞，细胞质内部呈现均匀的黄色(图4a)，而转染新构建重组质粒pB2R-Venus的细胞只在质膜部位发出黄色荧光(图4b)，说明在转染重组质粒pB2R-Venus的HEK293T细胞中，受体B2R表达较强烈，且仅表达于质膜。而在转染重组质粒的细胞中，没有受体B2R的表达，进一步说明载体构建正确且表达效率较高。

同样，蛋白印迹结果显示，在转染重组质粒pB2R-Venus的细胞中,出现两条带，其中一条分子量为44 kDa,与受体B2R的大小相同；而在仅转染质粒pVenus-N1的对照细胞中，没有目的蛋白的表达(图 5) ，说明空白细胞或对照细胞中，不表达目的基因。

a：转染pVenus-N1载体的细胞；b：转染重组质粒pB2R-Venus的细胞

A：pB2R-Venus的表达 B：β-actin的表达Lane 1：转染重组质粒pB2R-Venus的细胞Lane 2：仅转染对照质粒的细胞

图5 Western Blot检测重组质粒的表达

3 讨论

增强型黄色荧光蛋白(enhanced yellow fluorescent proteins，EYFP)是黄色荧光蛋白的突变体，由于其高灵敏性等优点，目前被广泛应用于众多实验研究。但EYFP的抗酸性差，且对卤化物敏感，因此其应用仍有诸多局限。在EYFP基础上改进的突变体Venus[6]荧光更亮，耐酸性更强，更稳定，且成熟更快，其应用将更加广泛，可作为生物传感器应用在相应组织和器官上。基于以上优点，Venus是目前应用最多的黄色荧光蛋白探针，可用于FRET实验，作为荧光蛋白配对、钙离子检测、双分子荧光互补等实验研究。本实验构建的pB2R-Venus融合蛋白，Venus作为标签蛋白不影响目的蛋白的折叠和运输，直接通过荧光显微镜就可观察受体在活细胞中的表达、内吞等动态过程。同时Venus荧光性质稳定，荧光强度不易受到细胞内其他物质的干扰，，从而使目的蛋白的检测更快、更简便、灵敏度更高、重现性更好。

激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kinin system，KKS)是重要的内源性调控途径，可参与血压调节、炎症、心血管内稳态、镇痛反应、疼痛传递、细胞因子释放、前列腺素和NO合成以及细胞增殖等生理学过程[7]。激肽释放酶作用于激肽原释放缓激肽(bradykinin，BK)，BK羧基末端的精氨酸水解后可生成Des-Arg9BK。BK与组成型表达的B2R亲和力较高，而Des-Arg9BK与诱导性表达的B1R亲和力较高[8]。B2R是GPCRs超家族的成员之一，而GPCRs是众多药物的作用靶点，是治疗疼痛、高血压、心血管疾病、帕金森等疾病的药物靶标。

实验选用的HEK293T细胞是永生化的细胞，转染效率高且本身不表达B2R蛋白，因此常用做转染的受体细胞检测转染质粒的表达。本实验构建的融合表达载体pB2R-Venus转染细胞后，荧光显微镜检测显示荧光蛋白表达于质膜，标签蛋白作为融合蛋白与受体B2R自内质网合成后转运至质膜。同时，Western blot也显示在未转染的细胞中没有受体的表达，而转染重组质粒的细胞中受体蛋白水平有较强的表达。实验构建的pB2R-Venus真核表达载体可用于后续的BRET或FRET实验，以研究受体间或受体与G蛋白、GRK以及arrestin等的相互作用[9-10]，同时还能用于动态观察受体在膜表面的表达、内吞及胞内运输过程。

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