EPO促进胚胎神经干细胞向神经元分化的形态学研究*

袁丽丽 马登殿 孔佑华

(1济宁医学院基础学院，山东 济宁 272067；2济宁医学院附属医院，济宁 272029)

近些年，促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对中枢神经系统的保护作用[1]研究较多。本实验镜下取大鼠14d天胚胎脑皮质行体外培养，鉴定为神经干细胞(nerual stem cells,NSCs)之后培养基中加入不同浓度的EPO继续体外培养，观察NSCs向神经元方向分化的形态学表现。

1 材料与方法

1.1 实验材料

成年雌雄未经产SD大鼠晚8：00合笼，次日晨8：00查到精子者记为E0d。

悬浮培养基：DMEM/F12(1∶1，Hyclone)，20 ng/mlEGF(Sigma)，20 ng/mlbFGF(Sigma)，2%B27(Gibco)，100 u/ml青霉素，100 μg/ml链霉素。贴壁分化培养基：DMEM/F12(1∶1，Hyclone)，10%FBS(杭州四季青)，100u/ml青霉素，100 μg/ml链霉素。

1.2 方法

1.2.1NSCs培养和鉴定

1.2.1.1NSCs的分离和传代及自然分化 取孕14d(E14d)SD大鼠胚胎脑皮质，用袁丽丽等[2-3]培养方法先悬浮培养传代3次，第3代(P3)细胞悬浮培养7d，收集部分细胞离心后待做电镜标本，其余悬浮细胞移入涂有L-多聚赖氨酸包被盖玻片的24孔培养板中加入分化培养基。放入培养箱培养6～8h，随机选取培养板，将盖玻片固定，待行nestin免疫细胞化学染色。其余培养板继续行分化培养，7d后取出细胞爬片固定，待行神经胶质原纤维酸性蛋白(glia fibrillary acid protein，GFAP)、微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2)免疫细胞化学染色。

1.2.1.2免疫细胞化学染色 Nestin、GFAP、MAP2进行免疫细胞化学染色[2]。

1.2.2EPO掺入实验

1.2.2.1分组 第3代NSCs悬浮及其后贴壁分化培养基中添加EPO，根据EPO终浓度0.5、5、50、500u/ml分为4个实验组，另设对照组(不加EPO)。培养方法同上。

1.2.2.2免疫荧光染色 NSCs爬片7d固定行MAP2免疫荧光染色[3]。后行激光共聚焦显微镜下观察并拍照。每组随机取4张盖玻片，每张400倍镜下随机选5个视野计数MAP2阳性细胞数及总细胞数，计算视野中MAP2阳性细胞百分率。实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS11.5统计学软件处理数据，各组率的比较采用χ2检验。

2 结 果

2.1 神经干细胞鉴定

2.1.1倒置相差显微镜及电镜观察结果 分离E14d鼠胚脑皮质得到单细胞，台盼蓝活细胞计数>96%，在生长培养基中细胞悬浮生长。第5～7天，形成神经球，可传代。电镜观察细胞核大，细胞器很少，核质比较大。见图1。

图1 NSCs悬浮生长7d电镜照片(×60000)

2.1.2免疫细胞化学染色观察结果 免疫细胞化学染色结果显示，nestin在神经球内细胞胞浆呈阳性表达，细胞浆被染成棕褐色 ，见图2。

图2 神经球爬片6h，免疫细胞化学染色示神经球内细胞nestin表达阳性(×400)

分化培养7d，GFAP：在部分细胞胞浆及突起中呈阳性表达，被染成棕褐色，胞体较大、突起粗而短，见图3。MAP2：在部分细胞胞浆及突起中呈阳性表达，细胞胞浆及突起呈棕褐色，见图4。

图3 神经球分化7d，免疫细胞化学染色示GFAP阳性细胞(×400)

图4 神经球分化7d，免疫细胞化学染色示MAP2阳性细胞(×400)

2.2 EPO掺入实验

2.2.1光镜观察 加入EPO分化培养，细胞透亮，折光较好，见图5，部分细胞伸出的突起细而长，随时间进行细胞突起形成复杂的网络。

图5 EPO 5u/ml组，神经干细胞分化培养4d光镜照片(×100)

2.2.2MAP2免疫细胞荧光化学染色及共聚焦显微镜观察 加入EPO分化培养7d，MAP2免疫细胞荧光染色共聚焦显微镜观察，示部分细胞胞浆及突起呈绿色荧光，MAP2表达阳性，见图6。

图6 EPO 5u/ml组，NSCs免疫荧光细胞化学染色， 示MAP2阳性细胞(×400)

各实验组对NSCs向神经元方向分化的影响如表1所示。

表1 加入EPO各组MAP2在神经元内的表达

注：*P<0.05，说明EPO浓度不同时，NSCs向神经元分化的比例不同或不全相同。

添加EPO各组分别与对照组比较(见图7)，MAP2表达阳性率EPO≥5u/ml各实验组显著高于对照组(P<0.05)。

*与对照组相比P<0.05

图7 EPO各实验组与对照组比较神经元表达阳性率

3 讨论

NSCs是当今科学研究热点之一。本实验分离胚胎大鼠脑皮质，经处理吹打成单细胞，在生长培养基对其悬浮培养，可获得悬浮生长的神经球，电镜结果显示，神经球内细胞核质比例较高，细胞器较少，此结果与一般干细胞形态特征相一致。nestin具有维持神经前体细胞正常形态的作用，在本实验将nestin作为NSCs的标记物，神经球爬片6～8h，其免疫细胞化学染色结果显示球内细胞均呈nestin阳性，表明生长培养基培养的细胞为NSCs，且具增殖潜能。在添加10%FBS的培养基中NSCs贴壁，7d后行免疫细胞化学染色，示分化细胞中部分表达MAP2阳性或GFAP阳性，表明本实验源于SD大鼠胚胎脑皮质的细胞体外培养，具有分化为神经元、星形胶质细胞的能力。

EPO为促红细胞生成素，在体内对NSCs的保护作用研究较多[4-5]，Yu等[4]的研究表明,在脑及脊髓EPO和其受体有抗细胞凋亡功能，对神经元正常发育有重要作用。体外培养可以研究单因素对NSCs的影响，本实验取材位置是SD大鼠胚胎脑皮质，前期实验结果[2]表明EPO在适当浓度下可抑制体外培养的NSCs凋亡。本实验NSCs爬片分化7d，MAP2免疫荧光细胞化学染色结果显示EPO≥5 u/ml各实验组阳性细胞表达率显著高于对照组(P<0.05)，表明适当剂量的EPO促进体外大鼠胚胎脑皮质NSCs向神经元方向分化。在体内促红细胞生成素EPO与促红细胞生成素受体(EPO-R)结合，激活蛋白酪氨酸激酶，在细胞内快速诱导多种蛋白质发生酪氨酸磷酸化，从而启动信号转导通路如Ras有丝分裂原激活蛋白激酶等将信号传到细胞核核因子1，控制NSCs增殖、分化。脑内皮细胞在促红细胞生成素直接作用下分泌脑源性神经生长因子(NGF)，后者通过作用于邻近细胞的旁分泌方式促进神经发生[6-9]。在体外EPO促进源于胚胎脑皮质的NSCs分化，推测可能原因：一方面，源于大鼠胚胎脑皮质的NSCs有与促红细胞生成素相结合的受体，体外培养基中加入EPO，EPO便与脑皮质NSCs上的EPO-R结合启动了信号传导通路而促进NSCs向神经元方向的分化，另一方面可能刺激了源于胚胎脑皮质的NSCs分泌神经生长因子，此因子作用于邻近神经干细胞，从而促进了NSCs向神经元方向的分化。NSCs向神经元方向分化的具体调控机制目前尚不清楚，受自身基因和外来信号等方面共同调节，下一步将继续深入探讨胚胎NSCs向神经元定向诱导分化的影响因素及其分化机制，为NSCs移植治疗中枢神经系统损伤及神经变性性疾病提供理论基础。

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[3] 袁丽丽,马登殿,杜红梅,等.促红细胞生成素促进体外鼠胚脑皮质神经干细胞增殖[J].解剖科学进展,2010， 16(6):550-553.

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