唐山大清河盐场中度嗜盐菌的分离及功能酶的筛选

胡居猛，贾瑞雪，吴乐天，杜文博，唐红梅

（河北联合大学 生命科学学院，河北 唐山 063000）

唐山大清河盐场中度嗜盐菌的分离及功能酶的筛选

胡居猛，贾瑞雪，吴乐天，杜文博，唐红梅

（河北联合大学 生命科学学院，河北 唐山 063000）

为了调查唐山大清河盐场的中度嗜盐菌资源，采集晒盐场的盐泥进行嗜盐菌的分离纯化，并进行形态学观察、生理生化特征鉴定和功能酶筛选。结果分离得到14株中度嗜盐菌。这些嗜盐菌的菌落呈黄色或者乳白色，较小，不透明，边缘整齐；细菌多呈杆状，革兰氏染色均呈阴性。生理生化特征鉴定显示，14株菌株中的3株甲基红试验阳性，3株伏-普试验阳性，3株可分解含硫的氨基酸，5株可利用柠檬酸作为碳源。多株菌可释放功能酶，其中6株产淀粉酶，7株产纤维素酶，7株产脂肪酶和6株产蛋白酶。该研究虽然仅获取了少量的中度嗜盐菌，但为开发利用唐山大清河盐场的嗜盐菌资源提供了参考。

中度嗜盐菌；分离；生理生化特征；功能酶

在日光盐场、盐碱地、海产品以及盐渍食品等高盐环境中，栖息着数目众多的嗜盐菌。不同类型的嗜盐菌对盐浓度的需求不同，其中中度嗜盐菌最适生长盐浓度为3% -15%（W/V）[1]。中度嗜盐菌不仅在高盐环境中容易生长繁殖，而且分泌的胞外酶在高盐环境下具有较高的活性，所以它被广泛地应用于污水处理、食品、化工等行业[2]。

我国拥有广阔的盐域环境和丰富的嗜盐菌资源，多位学者已经对新疆、四川、大庆等地的中度嗜盐菌进行研究[3-5]。目前的研究主要集中在分类特征、系统发育地位、渗透调节机制和生物学功能等方面，这为确立其分类和分布奠定理论基础，并且是合理利用这些微生物资源的重要前提。本文采集唐山大清河盐场的盐泥进行嗜盐菌的分离纯化，得到14株中度嗜盐菌，并对它们进行了形态学观察、生理生化特征鉴定和功能酶筛选。

1 材料与方法

1.1 材料

2013年4月采集唐山大清河盐场的盐土，装于无菌牛皮纸袋中，密封带回实验室，保存在4 ℃冰箱。

改良营养琼脂培养基（每升中含有蛋白胨7.5 g；酵母浸膏10 g；NaCl 50 g；琼脂20 g，pH 8.3）、生理生化鉴定培养基和产酶培养基均由河北联合大学生命科学学院中心实验室配制。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离和纯化

称取10.0 g盐土装入带有玻璃珠的无菌烧杯中，加90 mL无菌蒸馏水，震荡30 min充分混匀。取上清液倍比稀释涂布于含有5% NaCl（W/V）的改良营养琼脂培养基平板上，25 ℃培养3 d后，挑取不同类型的单菌落反复划线，直至获得纯种，保存备用。

1.2.2 形态学特征

划线接种于5% NaCl（W/V）的改良营养琼脂培养基平板，25 ℃培养3 d后，观察单菌落的形状、大小、透明度、颜色、边缘和表面特征。挑取少量菌体，稀释后固定，进行革兰氏染色，油镜下观察菌体形状、大小和染色反应。

1.2.3 生理生化试验

参见《常见细菌系统鉴定手册》[6]。

甲基红试验（M. R.试验）。将筛选出的菌株分别接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，32 ℃培养24 h，加甲基红指示剂5滴，观察结果。呈现红色者说明pH下降到4.2以下，为阳性，能够利用葡萄糖产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等；呈现黄色者pH值大于6，为阴性。

伏—普试验（V. P.试验）。将筛选出的菌株分别接种到葡萄糖蛋白胨水中，32 ℃培养24 h，加入40%KOH 7滴，然后再加入等量的5%a-萘酚溶液，用力振荡，再放入37 ℃温箱中保温30 min。若培养物呈现红色，则细菌能够利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，为伏—普反应阳性；若培养基仍为黄色，为阴性。

硫化氢试验。将筛选出的菌株用接种针穿刺接种到醋酸铅培养基中，32 ℃培养24 h，观察结果。若有黑色出现，则细菌具有分解含硫的氨基酸能力，为阳性；反之，为阴性。

柠檬酸盐利用试验。将筛选出的菌株接种到柠檬酸盐培养基上，32 ℃培养24 h后，观察结果。若培养基变深蓝色，细菌可利用柠檬酸盐作为碳源，为阳性；反之，不能利用，为阴性。

1.2.4 酶的筛选

淀粉酶。培养基中加入1%可溶性淀粉制成平板，接种菌液，25 ℃培养48 h后，碘液均匀铺于平板上，菌落周围若有透明圈说明该菌株可产生淀粉酶，为阳性；反之为阴性。

纤维素酶。将菌株接种至CMC-Na平板培养基，25 ℃培养48 h后，用0.1%的刚果红水溶液浸染30 min，菌落周围出现透明圈为阳性；反之为阴性。

脂肪酶。培养基中添加1% Tween 20制成平板，接种菌液25 ℃培养48 h，菌落周围若有白色晕圈，说明该菌株可代谢产生脂肪酶，为阳性；反之为阴性。

蛋白酶。菌株接种到含1%脱脂牛奶的培养平板25 ℃培养48 h，菌落周围若有白色晕圈，证明该菌株可代谢产生蛋白酶，为阳性；反之为阴性。

2 结果与分析

2.1 筛选结果

从大清河盐土的样品中分离得到具有代表性的14株中度嗜盐菌，依次编号为1-14。

2.2 形态学特征

这些菌株形成的菌落呈黄、白色两种颜色，较小，圆形，向上隆起，不透明，边缘整齐。细菌的革兰氏染色呈阴性。细胞的形状大部分是杆状，少数为球状；大小不一，最大长度达1 μm，最小的只要0.2 μm。结果如表1所示。

表1 菌株的染色反应

2.3 生理生化特征

结果如表1所示，菌株2、3和9能够利用葡萄糖产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等；菌株6、7和9具有利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力；菌株4、6、7具有分解含硫的氨基酸能力；菌株4、6、7、11和13能利用柠檬酸盐为碳源。

2.4 功能酶

结果如表1所示，1、3、4、6、8和9这6株菌株具有产淀粉酶的能力；菌株2、3、6、7、9、10和12均可产纤维素酶降解纤维素，其中3，9和10这3株产酶较多，透明圈与菌落的直径比达4.0倍。1、3、5、6、7、9和13菌株可以产脂肪酶，其中菌株9产酶量最多，透明圈与菌落的直径比是1.8倍。2、3、7、9、12和13号菌株能产生蛋白酶，比较而言菌株7产酶量最多，透明圈与菌落的直径比是1.7倍。

3 讨论

嗜盐菌通常是指需要NaCl才能生长的微生物，而不是分类学上的名词。研究表明，超过2 mol/L NaCl的条件下，嗜盐菌主要是古生菌，几乎不存在真细菌[7]。在研究中使用了5%（W/V）NaCl的培养基进行分离纯化，所以分离到的细菌全部是真细菌。细菌的确切种属，最可靠的证据是分析16S rDNA序列，这部分研究工作有待于进行。

随着分子生物学技术的快速发展，中度嗜盐菌的新种不断地被报道，这增加了嗜盐菌的多样性。值得注意的是，微生物对盐的耐受能力存在的差异，这取决于环境条件，所以不同的培养条件、营养均会影响到嗜盐菌的分离。富集到更多的嗜盐菌是进行嗜盐菌分类学研究的必要条件。该研究采用25 ℃、5% NaCl改良普通琼脂分离中度嗜盐菌，为这方面的研究工作提供了线索。

极端环境下的微生物体内的酶往往具有独特性质，如耐受高温、低温、高盐、高碱等外界条件。高盐环境下生长的嗜盐菌也不例外。从唐山大清河盐场分离的菌株中，多株嗜盐菌可释放胞外功能酶，个别菌株产酶活性较高。如果对这些菌株的产酶条件以及酶的性质深入研究，将具有重要的理论意义和应用前景。

[1] Ventosa A, Nieto J J, Oren A. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1998, 62(2): 504-544.

[2] 赵百锁,杨礼富,宋蕾,等.中度嗜盐菌在生物技术中的应用[J].微生物学通报,2007,34(2):359-362.

[3] 孟凡旭,吴敏,张会斌,等.阿牙克库木湖嗜盐茵的分离及功能酶的筛选[J].浙江大学学报(理学版),2006,33(6): 671-674.

[4] 冯玮,向文良,郭建华,等.四川大公古盐井中可培养中度嗜盐菌的初步分析[J].微生物学通报,2008,35(11): 1691-1697.

[5] 王爽,杨谦,孙磊,等.盐碱土中可培养中度嗜盐菌的研究[J].东北农业大学学报,2010,41(8):37-42.

[6] 李秀珠,蔡妙英.常用细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.

[7] Kamekura M. Diversity of extremely halophilic bacteria [J]. Extremophiles, 1998, 2(3): 289-295.

（责任编辑、校对：李春香）

The Isolation and Enzyme Screening of Moderate Halophilic Bacteria from Tangshan Daqinghe Saltwork

HU Ju-meng, JIA Rui-xue, WU Le-tian, DU Wen-bo, TANG Hong-mei
(College of Life Science, Hebei United University, Tangshan 063000, China)

The research aims to investigate the resources of moderate halophilic bacteria from Daqinghe saltwork of Tangshan. Mud samples are obtained from it, and 14 halophilic strains are isolated. They are small opaque colonies which are yellow or milky white. The cells of the isolates are mostly rod or cocci shaped and all the strains are gram negative. Physiological biochemical characteristics are analyzed. The important enzymes from these strains are screened subsequently. The results show that 6 strains produced amylase, 7 strains produced cellulose, 7 strains produced lipase and 6 strains produced protease. This research is to obtain a small amount of moderate halophilic bacteria, it provides references for reasonable development and utilization of halophilic microbial resources.

moderately halophilic bacteria; isolation; physiological biochemical characteristics; enzyme

Q93-3

A

1009-9115(2014)02-0052-03

10.3969/j.issn.1009-9115.2014.02.015

河北联合大学大学生创新实验（X2012057）

2013-11-08

胡居猛（1990-），男，江苏徐州人，本科生，研究方向为微生物学与分子生物学研究。

唐红梅（1973-），女，辽宁庄河人，博士研究生，副教授，研究方向为分子生物学。