软骨细胞生物打印后细胞活力分析

曲淼 沈聪聪 侯亦康 许佑荣 柴岗 高晓燕

软骨细胞生物打印后细胞活力分析

曲淼 沈聪聪 侯亦康 许佑荣 柴岗 高晓燕

目的初步确立软骨细胞的二维生物打印方法，实现对细胞喷射过程的控制并保持打印后的细胞活力。方法取原代软骨细胞，常规培养至第2代。实验分2组：打印组，快速成型组织打印机进行二维细胞打印，X轴间隔300 μm，Y轴间隔1 500 μm，激光共聚焦显微镜观察，经生物打印后培养2 h，Live/Dead viability Kit测定细胞活力，激光共聚焦显微镜观察细胞荧光染色情况；对照组除细胞悬液不行打印，其余操作同打印组。结果打印组细胞激光共聚焦显微镜观察，“细胞墨滴”在二维组织中均匀分布，满足二维设计细胞打印的要求，每个“细胞墨滴”含细胞15~35个。细胞活力测试显示，打印组细胞活力与对照组无明显区别。结论通过生物打印技术可实现软骨细胞在二维平面上的定向、定量规则分布，为进一步的细胞三维打印乃至器官打印体系奠定基础。

软骨细胞细胞打印组织工程

软骨缺损或损伤一直是临床治疗的难题，组织工程技术为软骨缺损的修复提供了新方法[1-2]。但是，组织工程技术无法同时、精确地将不同的细胞和细胞外基质直接定位在三维支架内，尚无法实现工程化生产人造组织和器官。细胞打印技术的出现，为生产人造组织和器官提供了一种全新的方法，被认为是可应用于组织工程的最具潜力的技术之一。细胞打印技术的基本原理，是将活细胞/基质作为堆积对象，经过计算机辅助层层堆积，精确定位，形成三维活性多细胞体系。避免打印细胞受损是该技术工程化亟待解决的关键问题之一。本实验即以软骨细胞为研究对象，探讨软骨细胞经细胞打印后的存活率以及细胞活性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

8周龄杂交猪（上海川沙养殖场），雌雄不限。

胎牛血清（FBS）、DMEM培养液（GIBCO公司，美国）；0.25%胰蛋白酶（Amresco公司，美国）；0.2%Ⅱ型胶原酶（Serva公司，德国）；Live/Dead viability Kit（Invitrogen公司，美国），Kit包含两种试剂：钙黄绿素AM（10 μmol/L，激发频率/发射频率为495 nm/ 515 nm）和溴乙非啶同型二聚体1（10 μmol/L，激发频率/发射频率为495 nm/635 nm），前者进行活细胞测试，后者进行细胞膜排除测试。

快速成型组织打印机由本实验室自行组装，对其进行打印系统消毒和改装，将彩色喷头改造为细胞喷头（直径50 μm）；激光共聚焦显微镜（Leica公司，德国）；倒置显微镜（Olympus公司，日本）。

1.2 软骨细胞的分离和培养

取猪耳软骨，去除软骨膜，剪成0.3 cm×0.3 cm大小，0.25%胰蛋白酶预消化30 min，0.2%Ⅱ型胶原酶消化8~12 h，过滤、离心、洗涤、计数。以含10%FBS的DMEM重悬后，按2.0×104cells/cm2的密度接种于10 cm培养皿，于37℃、5%CO2、100%饱和湿度下培养。待细胞生长近80%~90%融合时，常规消化传代培养，收集第2代细胞备用。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞打印参数的优化

取第2代软骨细胞，DMEM（含10%FBS）重悬细胞，调整为1×106cells/mL单细胞悬液。将单细胞悬液通过快速成型组织打印机进行二维细胞打印，X轴间隔为300 μm，Y轴间隔为1 500 μm，打印速度为20 mm/s，频率50 Hz，打印后用10 cm培养皿收集细胞，作为打印组。

1.3.2 打印后细胞活力检测

将打印后的软骨细胞培养2 h，以Live/Dead viability Kit测定细胞活力，以钙黄绿素AM、溴乙非啶同型二聚体室温下孵育细胞30~45 min，进行免疫荧光检测，激光共聚焦显微镜观察，作为打印组。对照组：除不行打印细胞悬液外，其余操作均同打印组。

2 结果

2.1 细胞打印参数的优化

打印组的细胞激光共聚焦显微镜观察显示，“细胞墨滴”在二维组织中规则且均匀分布，满足二维设计细胞打印要求。“细胞墨滴”排列基本达到实验设计的X轴间隔300 μm，Y轴间隔1 500 μm，每个“细胞墨滴”含细胞15~35个（图1）。

图1 软骨细胞经二维生物打印后的分布（激光共聚焦显微镜，100×）Fig.1Distribution observation of chondrocytes after biological two-dimensional printing (Laser scanning confocal microscope,100×)

2.2 打印后细胞活力检测

打印组细胞经免疫荧光处理，室温下孵育30 min，激光共聚焦显微镜观察显示细胞荧光染色情况，红色荧光示细胞失活，绿色荧光示细胞有活力。打印组细胞活力与对照组无明显区别（图2）。

图2 打印后2 h细胞活力检测（激光共聚焦显微镜，40×）（绿色荧光示细胞活力正常，红色荧光示细胞死亡）Fig.2Cell viability test 2 hours after printing(Laser scanning confocal microscope,40×)(green fluorescence:cells with normal viability;red fluorescence:dead cells)

3 讨论

组织工程的基本原理，是将组织细胞或干细胞贴附于生物相容性良好的生物材料上，形成细胞—生物材料复合物，植入到体内特定部位，或置于体外特定环境下，在生物材料逐步降解的同时，细胞产生基质，形成新的具有特定形态、结构及功能的相应组织[3]。但是传统的组织工程技术存在着不可忽视的缺陷：①工程化的组织和器官在形态、力学、生物化学和功能上的分化需要几周时间，成为产业化亟待解决的关键问题之一；②人体器官和组织的构成极其复杂，通常是由多种细胞和细胞外基质构成，现有技术难以将不同物质同时放置在三维支架中[4]，同时也难以精确地将不同细胞和细胞外基质直接定位于三维支架内；③构造的组织或器官内缺少血管，无法供应氧气和养料，易导致组织或器官坏死[5]；④受支架技术空间分辨率的限制，细胞渗透至支架材料内部的速度很慢[6]。因此，传统的组织工程技术尚无法实现工程化生产人造的组织和器官。

细胞打印是目前生物制造技术中最具有生命力的技术之一，具有广阔的应用前景。细胞打印目前处于初步研究阶段，但是也取得了一定成果，可以用来打印不同种类的细胞，经合理培养可自行融合，形成复杂的三维组织，具有巨大的应用潜能。Barron等[7]将多层的人类骨肉瘤细胞成功打印到了人工基底膜上，形成了三维的细胞结构，并且经过存活测试，打印后细胞的存活率高于95%。Xu等[8]分别将老鼠胚胎主运动元细胞、老鼠胚胎大脑皮质神经元和海马神经元成功打印出来，而且实验验证了打印后的细胞可以形成具有一定形态的简单结构[9]。Ringeisen等[10]继而成功打印了成纤维细胞等普通细胞，并能形成特定的三维结构。

然而，目前细胞打印系统也存在缺陷：①喷头易堵塞；②墨水的频繁回填易造成生物材料的污染；③不能进行高黏度液体打印；④打印后细胞的活性下降。另外，打印后的细胞仍需要细胞外基质以实现其长期培养。如何减少打印过程中的细胞受损是目前细胞打印技术存在的严峻挑战之一。细胞的存活率与细胞的种类、涂层材料特性及其厚度，以及外部环境的变化有关，在细胞液滴的形成和喷射过程中也会使打印细胞受力，细胞可能受到机械损伤和热损伤。细胞在打印过程中液滴的加速度高达109 g[11]，细胞在如此高的加速度作用下有可能会影响其活性。此外，在细胞着落过程中，涂层的厚度与喷射速度也是两个典型的影响细胞活力的打印因素。

但目前为止，大部分细胞打印实验设计针对的是打印细胞的活性，而对细胞打印方式缺乏深入研究。打印时间间隔和打印驱动脉宽等打印控制参数对细胞损伤的影响，以及单细胞悬液的密度对打印效果的影响等缺乏详实的分析，也缺乏细胞打印过程中细胞受损的理论依据，不但限制其应用，而且也严重阻碍了专用细胞喷射装置的研制，无法实现工程化细胞打印。所以，在细胞打印过程中细胞或细胞/基质喷射过程的控制，使打印后细胞快速、精确地定位于目标区域，并保持打印后的细胞活力、维持正常细胞形态且继续生长，是十分重要的问题。

我们的研究旨在解决这两个问题，通过二维设计决定细胞打印间隔，包括平面X、Y轴二维细胞分布，调整细胞打印参数，实现“细胞墨滴”在打印组织中的二维定向分布；通过打印细胞悬液中的浓度来决定“细胞墨滴”的浓度，调整“细胞墨滴”中细胞数量，实现细胞在三维组织结构中的定量和定点分布，使打印后的细胞能够快速、精确地定位于目标区域。打印后细胞的活力测试表明能使细胞所受损伤降至最低甚至零损伤，提示软骨细胞的生物打印完全可行，并为进一步的三维组织打印乃至器官打印体系研究奠定了基础。

[1]Langer R,Vacanti JP.Tissue engineering[J].Science,1993,260 (5110):920-926.

[2]Rahfoth B,Weisser J,Sternkopf F,et al.Transplantation of allograft chondrocytes embedded in agarose gel into cartilage defects of rabbits[J].Osteoarthritis Cartilage,1998,6(1):50-65.

[3]Burg KJ,Boland T.Minimally invasive tissue engineering composites and cell printing[J].IEEE Eng Med Biol Mag,2003,22(5):84-91.

[4]Nakamura M,Kobayashi A,Takagi F,et al.Biocompatible inkjet printing technique for designed seeding of individual living cells [J].Tissue Eng,2005,11(11-12):1658-1666.

[5]Mironov V,Visconti RP,Kasyanov V,et al.Organ printing:tissue spheroids as building blocks[J].Biomaterials,2009,30(12):2164-2174.

[6]Mironov V,Visconti RP,Kasyanov V,et al.Bioprinting:directed tissue self-assembly[J].Chem Eng Prog,2007,103(12):12-17.

[7]Barron JA,Spargo BJ,Ringeisen BR.Biological laser printing of threedimensional cellular structures[J].Appl Phys A,2004,79(4-6):1027-1030.

[8]Xu T,Jin J,Gregory C,et al.Inkjet printing of viable mammalian cells[J].Biomaterials,2005,26(1):93-99.

[9]Xu T,Gregory CA,Molnar P,et al.Viability and electrophysiology of neural cell structures generated by the inkjet printing method [J].Biomaterials,2006,27(19):3580-3588.

[10]Ringeisen BR,Kim H,Barron JA,et al.Laser printing of pluripotent embryonal carcinoma cells[J].Tissue Eng,2004,10(3-4):483-491.

[11]Hopp B,Smausz T,Barna N,et al.Time-resolved study of absorbing film assistedlaser induced forward transfer of Trichodermalongibrachiatum conidia[J].J Phys D Appl Phys,2005,38(6):833-837.

Viability Assay on Biological Printing of Chondrocytes

ObjectiveTo establish a two-dimensional biological printing technique of chondrocytes so as to control the cell transfer process and keep cell viability after printing.MethodsPrimary chondrocytes were obtained from auricles of 8-week-old piglets and then were regularly sub-cultured to passage 2(P2).The experiment was divided into 2 groups:printing group and control group.In printing group,P2 chondrocytes were transferred by rapid prototype biological printer(interval in x-axis 300 μm,interval in y-axis 1 500 μm),and were then cultured for 2 hours,afterwards cell viability was detected by Live/Dead viability Kit and cell fluorescence was observed by laser scanning confocal microscope;In control group,all steps were the same as printing group except that cell suspension received no printing.ResultsLaser scanning confocal microscope observation on the cells in printing group revealed the“cell ink droplets”.They were distributed regularly and evenly in the two-dimensional layer and each contained 15-35 cells,meeting the requirement of designing two-dimensional cell printing.The cells in printing group went through cell viability test,laser scanning confocal microscope observation showed that it was no significant difference between the control group and the printing groups in terms of cell viability. Conclusion Biological printing technique can realize the oriented,quantificational and regular distribution of chondrocytes in the two-dimensional plane and lays the foundation for the construction of three-dimensional cell printing or even organ printing system.

Chondrocytes;Cell printing;Tissue engineering

R319

A

1673－0364（2014）01－0011－03

QU Miao1,SHEN Congcong1,HOU Yikang1,XU Yourong1, CHAI Gang1,GAO Xiaoyan2.
1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China;2 Shanghai Zhoupu Hospital,Shanghai 201318,China.Corresponding author:CHAI Gang(E-mail:13918218178@163.com); GAO Xiaoyan(E-mail:gxyhelen@126.com).

2013年11月19日；

2013年12月26日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.01.004

国家自然科学基金项目（30600650）；上海市自然基金资助项目（13ZR1437500）；2012年浦东新区卫生系统优秀青年医学人才培养基金资助项目（PWRq2012-14）。

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科，上海市组织工程研究重点实验室（曲淼，沈聪聪，侯亦康，许佑荣，柴岗）；201318上海市上海市周浦医院（高晓燕）。

柴岗（E-mail：13918218178@163.com）；高晓燕（E-mail：gxyhelen@126.com）。