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RP-HPLC法同时测定复方维A酸乳膏中尿囊素、维A酸、异维A酸和维生素E的含量

2014-02-03张志勤朱昌辉韩国柱唐泽耀大连市皮肤病医院辽宁大连60大连医科大学药理教研室辽宁大连6044

中国药房 2014年12期
关键词:柱温异维乳膏

张志勤,李 玫,朱昌辉,王 栋,韩国柱,唐泽耀(.大连市皮肤病医院,辽宁大连 60;.大连医科大学药理教研室,辽宁大连 6044)

RP-HPLC法同时测定复方维A酸乳膏中尿囊素、维A酸、异维A酸和维生素E的含量

张志勤1*,李 玫2,朱昌辉1,王 栋1,韩国柱2,唐泽耀2(1.大连市皮肤病医院,辽宁大连 116021;2.大连医科大学药理教研室,辽宁大连 116044)

目的:建立同时测定复方维A酸乳膏中尿囊素、维A酸、异维A酸和维生素E含量的方法。方法:采用反相高效液相色谱法。色谱柱为ODSSyncronis C18,流动相为甲醇-水-0.5%冰醋酸(梯度洗脱,采用不同的流速和检测波长),进样量为20μl,柱温为35℃。结果:尿囊素、维A酸、异维A酸、维生素E的检测质量浓度分别在125~2 000、12.5~200、6.25~100、250~4 000μg/m l范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系(r=0.999 8、0.999 9、0.999 8、0.999 9);精密度、稳定性、重复性试验的RSD≤0.88%;平均加样回收率分别为99.5%、97.6%、99.8%、99.0%,RSD分别为0.24%、0.97%、0.18%、0.72%(n=6)。结论:该方法操作简便、快速、准确,适用于同时测定复方维A酸乳膏中尿囊素、维A酸、异维A酸和维生素E的含量。

复方维A酸乳膏;尿囊素;维A酸;异维A酸;维生素E;反相高效液相色谱法

维A酸类药物被广泛应用于临床皮肤科,被称为皮肤治疗学的“第三里程碑”[1]。维A酸乳膏常外用于皮肤疾病的治疗,如痤疮、角化异常性皮肤病、光老化性皮肤病、银屑病、扁A酸被氧化破坏,提高维A酸的稳定性,减少细胞膜脂质和脂蛋白的过氧化,还具有较强的保湿作用,从而与维A酸起协同作用[5-6]。尿囊素可促进细胞生长,加快伤口愈合,软化角质蛋白,可用于缓解和治疗皮肤干燥症、鳞屑性皮肤病等,与维A酸和维生素E具有协同作用[7-8]。近年研制的复方维A酸乳膏(批准文号:辽药制字LBH00782005),主要成分为维A酸、维生素E和尿囊素[9-10],为O/W型乳膏。为提高复方维A酸乳膏的疗效及稳定性,更好地控制其质量,笔者采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法建立了同时测定其中尿囊素、维A酸、异维A酸和维生素E含量的方法。

1 材料

Utimate 3000HPLC仪(美国戴安公司);SB-5200D超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司),BS-110S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

复方维A酸乳膏(大连市皮肤病医院自制,O/W型,含维A酸、尿囊素、维生素E分别为0.1%、1%、2%,批号:121201、121201-1、121201-2、121201-3);尿囊素、维A酸、异维A酸和维生素E对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111501-200202、100307-200902、100224-200903、100062-201110);冰醋酸(分析纯,购于天津市科密欧化学试剂有限公司);甲醇(色谱纯,美国Tedia公司);水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:ODSSyncronis C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-水-0.5%冰醋酸,梯度洗脱程序及检测波长见表1;进样量:20μl;柱温:35℃。

表1 流动相梯度洗脱程序及检测波长Tab 1 Gradient elution process ofmobile phase and detection wavelength

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品贮备液的制备 精密称取尿囊素0.5 g、维生素E 1.0 g,分别置于10m l量瓶中,再精密称取维A酸0.1 g、异维A酸0.05 g,置于同一10m l量瓶中,分别加入甲醇加热溶解并稀释至刻度,摇匀,即得尿囊素对照品贮备液、维生素E对照品贮备液、维A酸和异维A酸对照品混合贮备液。

2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密量取尿囊素对照品贮备液2m l、维生素E对照品贮备液2m l、维A酸和异维A酸对照品混合贮备液1m l,置于50m l量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即得对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备 精密称取样品5 g,加甲醇80m l,置于索氏提取器中水浴加热回流4 h,提取液转移至100m l量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即得供试品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 称取不含维A酸、维生素E、尿囊素的样品5 g,按“2.2.3”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

分别取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液适量,在“2.1”项色谱条件下进样测定,色谱见图1。结果显示,尿囊素、异维A酸、维A酸、维生素E保留时间分别是5.38、15.43、17.25、27.79min,分离度均>1.5,理论板数均不低于3 000。

图1 高效液相色谱图A.对照品;B.供试品;C.阴性对照;1.尿囊素;2.异维A酸;3.维A酸;4.维生素EFig 1 HPLC chromatogram sA.substance control;B.teat sample;C.negative control;1.allantoin;2.isomerization A acid;3.vitam in A acid;4.vitam in E

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.2”项下对照品液50、25、12.5、6.25、3.125m l,置于50m l量瓶中,加甲醇稀释至刻度,得到系列浓度溶液。按“2.1”项下色谱条件分别吸取20μl进样,记录色谱。以各成分峰面积(y)为纵坐标,检测质量浓度(x,μg/m l)为横坐标,进行线性回归,回归方程和线性范围详见表2。

表2 回归方程和线性范围Tab 2 Regression equation and linear range

2.5 精密度试验

精密量取“2.2.2”项下对照品溶液20μl,分别按“2.1”项下色谱条件于1 d内重复进样测定5次和连续测定5 d。结果,尿囊素、维A酸、异维A酸、维生素E的日内RSD分别为0.42%、0.59%、0.80%、0.43%,日间RSD分别为0.55%、0.81%、0.40%、0.37%,表明本方法日内、日间精密度均良好。

2.6 稳定性试验

取样品(批号:121201)5 g,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,25℃下放置,分别于0、24、48、72、96 h时进样测定。结果,尿囊素、维A酸、异维A酸、维生素E的RSD分别为0.26%、 0.59%、0.63%、0.52%,表明96 h内供试品溶液稳定性良好。

2.7 重复性试验

取样品(批号:121201)5 g,共6份,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,并按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果,尿囊素、维A酸、异维A酸、维生素E的RSD分别为0.32%、0.59%、0.69%、0.88%,表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知各成分含量的样品(批号:121201)6份,每份5 g,分别置于100m l量瓶中,各精密加入“2.2.2”项下对照品溶液25m l,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定并计算加样回收率,结果见表3。

表3 加样回收率试验结果(n=6)Tab 3 Results of recovery tests(n=6)

2.9 样品含量测定

取3批样品各适量,按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,并按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱,按外标法以峰面积计算各成分含量,结果见表4。

表4 样品含量测定结果(mg/g,n=3)Tab 4 Content determ ination of sam p les(mg/g,n=3)

3 讨论

笔者采用RP-HPLC法,不仅同时测定了复方维A酸乳膏中维A酸、尿囊素和维生素E三组分的含量,还测定了降解产物异维A酸的含量。由于维生素E和维A酸为脂溶性成分,尿囊素为水溶性成分,维A酸与异维A酸又互为异构体,因此笔者采用梯度洗脱方式在0~6m in,采用5%甲醇水溶液洗脱尿囊素;在>6~18m in,采用甲醇-0.5%冰醋酸进行洗脱,减慢流速为1m l/min,使维A酸与异维A酸达基线分离,>18~30 m in,采用100%纯甲醇洗脱维生素E。

为缩短保留时间,笔者曾在流动相中加入异丙醇和四氢呋喃,但发现保留时间无显著改变,且加入四氢呋喃后异维A酸与维A酸分离度反而降低,故均未采用。笔者又尝试提高柱温,通过对25、30、35、40℃不同柱温的研究发现,随着柱温的升高,样品的保留时间逐渐缩短,当柱温达到40℃时维A酸与异维A酸分离度降低,因此选用35℃柱温。

在本试验中,笔者分别对150mm和250mm的色谱柱进行了比较。结果表明,150mm色谱柱保留时间较250mm略有缩短,但是异维A酸与维A酸的分离度在选用250mm色谱柱时显著优于150mm(150mm异维A酸与维A酸的分离度小于1.5),故选用250mm的C18色谱柱,进样时间30min。

综上所述,本法操作简便、快速、准确,适用于同时测定复方维A酸乳膏中尿囊素、维A酸、异维A酸和维生素E的含量。

[1]杨彤.美容药物学[M].北京:人民卫生出版社,2002:69.

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Simultaneous Determ ination of Allantoin,Tretinion,Isomerization A Acid and Vitam in E in Com pound Tretinion Cream by RP-HPLC

ZHANG Zhi-qin1,LIMei2,ZHU Chang-hui1,WANG Dong1,HAN Guo-zhu2,TANG Ze-yao2(1.Dalian Dermatology Hospital,Liaoning Dalian 116021,China;2.Dept.of Pharmacology,Dalian Medical University,Liaoning Dalian 116044,China)

OBJECTIVE:To develop a method for simultaneous determ ination of allatoin,tretinion,isomerization A acid and vitam in E in Compound tretinion cream.METHODS:RP-HPLC method was adopted.The determ ination was performed on ODS Syncronis C18column w ith mobile phase consisted of methanol-water-0.5%glacial acetic acid(gradient elution at different flow rates and detection wavelength);sample size was 20μl and column temperature was 35℃.RESULTS:The linear ranges were 125-2 000μg/m l for allantoin(r=0.999 8),12.5-200μg/m l for tretinoin(r=0.999 9),6.25-100μg/m l for isomerization A acid(r=0.999 8)and 250-4 000μg/m l for vitam in E(r=0.999 9).RSDs of precision,stability and reproducibility tests were lower than 0.88%.Average recoveries were 99.5%(RSD=0.24%,n=6),97.6%(RSD=0.97%,n=6),99.8%(RSD=0.18%,n=6)and 99.0%(RSD=0.72%,n=6).CONCLUSIONS:Themethod is simple,rapid,accurate and suitable for the content determ ination of allatoin,tretinion,isomerization A acid and vitam in E in Compound tretinion cream.

Compound tretinion cream;A llantoin;Tretinion;Isomerization A acid;Vitam in E;RP-HPLC平疣及皮肤肿瘤等[2-3]。但是,现有市售的维A酸乳膏均为单方制剂,稳定性较差,维A酸极易见光异构化降解产生异维A酸,疗效并不理想[4]。维生素E为强抗氧化剂,能阻止乳膏中维

R917

A

1001-0408(2014)12-1131-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.12.26

*药师,硕士。研究方向:药物制剂与质量控制。电话:0411-83781004。E-mail:zhangzhiqin_520666@163.com

2013-10-24

2013-11-26)

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