瑶药天钻的质量标准研究Δ

张亚洲，樊兰兰，覃山丁，李典鹏（.广西壮族自治区药用植物园天然药物化学中心，南宁 530023；2.广西壮族自治区/中国科学院桂林植物研究所，广西桂林 54006）

瑶药天钻的质量标准研究Δ

张亚洲1，2＊，樊兰兰1，覃山丁1，李典鹏2#（1.广西壮族自治区药用植物园天然药物化学中心，南宁 530023；2.广西壮族自治区/中国科学院桂林植物研究所，广西桂林 541006）

目的：建立瑶药天钻药材的质量标准。方法：分别对天钻药材进行显微鉴别和薄层色谱（TLC）鉴别；按照《中国药典》方法进行水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物检查；采用高效液相色谱法测定药材中马兜铃酸的含量：色谱柱为Phenomenex Gem iniC18（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-水（含0.34%三乙胺、0.94%乙酸，梯度洗脱），检测波长为260 nm。结果：天钻药材的显微特征明显；TLC图中能清晰显现与马兜铃酸A对应的点；马兜铃酸A的质量浓度在1.703～109.000μg/m l范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系（r＝0.999 9），平均加样回收率分别为97.54%、101.16%、101.15%，RSD分别为0.22%、0.63%、0.39%（n＝3）。结论：所建标准可用于天钻药材的质量控制。产自广西、云南的11批天钻药材在显微、外观等方面质量相对稳定，但马兜铃酸A的含量差异较大。

天钻；马兜铃酸A；质量标准；瑶药

＊助理研究员，博士。研究方向：天然药物的活性成分和代谢。E-mail：yazhou_zhang2009@163.com

#通信作者：研究员，硕士研究生导师，博士。研究方向：药物资源功能物质开发。E-mail：ldp@gxib.cn

瑶药天钻是马兜铃科马兜铃属植物广西马兜铃Aristolochia kwangsiensisChun etHow ex C.F.Liang的块根[1]，别名金银袋、大总管、萝卜防己、大青木香，原植物主要分布于浙江、福建、湖南、广东、广西、四川、贵州、云南等地的山谷林中[1-3]。文献研究显示，从天钻中分离出了尿囊素、马兜铃酸、β-谷甾醇、6-甲氧基去硝基马兜铃酸甲酯、6-甲氧基马兜铃酸A甲酯及木兰花碱[2-3]。药理研究发现：（1）其总生物碱具有解痉、镇痛作用[3-4]；（2）马兜铃酸主要有抗肿瘤、致突变与肾脏毒性作用[2-5]；（3）天钻提取物对临床各种疾患所致平滑肌痉挛性腹痛的止痛效果较好[6]。目前，天钻常作为抗肿瘤、止痛药物使用，但是其质量标准尚未见研究报道。鉴于此，笔者对天钻药材中可引起肾毒性的成分马兜铃酸A的薄层色谱（TLC）鉴别方法和高效液相色谱（HPLC）含量测定方法进行了研究，制定了其含量限度，并完成了其他检查项目，以期科学、有效地控制药材质量，保证其临床疗效和安全性。

1 材料

1.1 仪器

1200型HPLC仪，含紫外检测器等（美国Agilent公司）；HD-1024A型超声仪（宁波市恒大超声设备有限公司，功率：1 200 W，频率：25～28 kHz）。

1.2 试剂

马兜铃酸A对照品（笔者自制，经HPLC法测定纯度＞98%）；硅胶G（青岛海洋化工厂）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.3 药材

天钻药材共11批（样品信息见表1），均经广西中医药研究院方鼎研究员鉴定其来源为广西马兜铃。完成样品收集后，将所有11批样品（约100 g）进行粉碎处理，并统一过40目筛，备用。

表1 天钻药材样品信息Tab 1 Information of A.kwangsiensis sam p le

2 方法与结果

2.1 性状与显微、TLC鉴别

2.1.1性状鉴别 天钻块根肥大，呈纺锤形，长30～60 cm。表面棕褐色，有时有须根或须根痕。质坚而硬，断面类白色，木部宽广，淡黄或白色，气微香特异，味苦。

2.1.2 显微鉴别 ①块根横切面：木栓层由10余列长方形细胞组成，栓化并木化，皮层中有单个或数个成群散在的石细胞；韧皮部宽广，韧皮部薄壁细胞中含有大量的淀粉粒，形成层不明显；木质部宽广，射线宽1～3列细胞，导管大小不一，多单个呈径向排列。②本品粉末棕色；淀粉粒众多，类圆形、类球形或不规则，单粒或复粒，复粒由2～8个单粒组成，单粒直径为6～36µm，层纹明显；石细胞众多，类方形或多角形，黄色，单个散在或多个成群，孔沟明显，直径20～60µm；草酸钙簇晶常见，直径5～12µm；木栓细胞类方形，内含棕色物，直径8～15µm；具缘纹孔导管多破碎，直径20～40µm；纤维束偶见，长40～200µm。

显微鉴别要点：淀粉粒众多，黄色石细胞孔沟明显，单个或聚集成群，可见草酸钙簇晶，这是其显微鉴别的主要特征。显微鉴别图见图1、图2。

图1 天钻块根横切面的显微全貌图1.木栓层；2.石细胞；3.韧皮部；4.淀粉粒；5.形成层；6.木质部；7.木射线；8.髓Fig 1 M icrograph of the transaction of the roots of A.kwangsiensis1.phellem layer；2.lithocyte；3.phloem；4.starch grain；5.cambium layer；6.xylem；7.xylem rays；8.pith

图2 天钻粉末的显微鉴别图Fig 2 M icrograph of the powder of A.kwangsiensis

2.1.3 TLC鉴别 取本品粉末0.5 g，加石油醚（60～90Ⅱ）50 m l，超声提取30min，滤过，残渣加甲醇30m l，再超声提取30 min，滤过，滤液浓缩至干，用甲醇2m l使溶解，作为供试品溶液。另取马兜铃酸A对照品，加甲醇制成每1m l含2mg的溶液，作为对照品溶液。照TLC法[7]试验，吸取上述两种溶液各2µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-乙酸（4∶1∶2滴）饱和8min为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。结果显示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点。天钻的TLC图见图3。

图3天钻的TLC图S.马兜铃酸A对照品；1～11.天钻药材样品Fig 3 TLC of A.kwangsiensisS.aristolochic acid A control；1-11.A.kwangsiensis samples

2.2 检查

2.2.1 水分 照水分测定法[7]测定，可得11批样品的水分含量均在16.0%以下。考虑到该药材为南方所产，而南方气候较为湿润，因此将本品水分限度拟定为不得过16.0%。

2.2.2 总灰分 照灰分测定法[7]测定，可得11批样品的总灰分含量均在6.0%以下，故将本品总灰分限度拟定为不得过6.0%。

2.2.3 酸不溶性灰分 照灰分测定法[7]测定，可得11批样品的酸不溶性灰分含量均在2.0%以下，故将本品酸不溶性灰分限度拟定为不得过2.0%。

2.2.4 浸出物 查阅相关文献可知，天钻中的活性成分聚集在乙酸乙酯部位，且该成分为脂溶性成分[2-6]。因此，初步考虑采用醇溶性浸出物来考察天钻中所含的活性成分；而加热提取一方面有利于化学成分的溶出，另一方面又节省了试验时间，最终确定采用热浸法进行试验。预试验还比较了50%乙醇与95%乙醇作为提取溶剂的提取效果，结果表明，50%乙醇的提取效果较优（以TZ-1为供试品，前者浸出物含量为15.36%，后者浸出物含量为11.40%），故最终确定以50%乙醇为提取溶剂。照醇溶性浸出物测定法项下的热浸法[6]测定，可得本品11批浸出物的含量均在8.0%以上，故将本品浸出物含量限度拟定为不少于8.0%。

2.3 含量测定[8-9]

2.3.1色谱条件 色谱柱：Phenomenex GeminiC18（250mm× 4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（含0.34%三乙胺、0.94%乙酸），梯度洗脱（洗脱程序见表2）；流速：1m l/min；检测波长：260 nm；柱温：室温。色谱见图4。

表2 梯度洗脱程序Tab 2 Gradientelution process

图4 高效液相色谱图A.马兜铃酸A对照品；B.天钻药材样品Fig 4 HPLC chromatogram sA.aristolochic acid A control；B.A.kwangsiensis sample

2.3.2线性关系考察 精密称取马兜铃酸A对照品21.8mg，置于100m l量瓶中，用甲醇超声溶解后放至室温，再用甲醇稀释至刻度，得溶液①。取溶液①5m l，置于10m l量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得溶液②。取溶液①25m l，置于100m l量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得溶液③。取溶液③5m l，置于10m l量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得溶液④。取溶液④5m l，置于10m l量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得溶液⑤。取溶液⑤5m l，置于10m l量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得溶液⑥。取溶液⑥5m l，置于10m l量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得溶液⑦。取溶液⑦5m l，置于10m l量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得溶液⑧。取以上②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧溶液各20μl，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积积分值（y）为横坐标，对照品质量浓度（x）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为x＝0.009 8y+0.050 7（r＝0.999 9，n＝7）。结果显示，马兜铃酸A的质量浓度在1.703～109.000μg/m l范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.3.3供试品溶液的制备 精密称取样品约0.5 g，置于50m l量瓶中，用甲醇超声30min溶解后放至室温，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，以0.45μm微孔滤膜滤过，即得。取20μl进样。

2.3.4 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品（编号：TZ-6）0.23 g，平行9份，每3份为一组，分别加入已知样品中马兜铃酸A含量的125%、100%、75%的对照品，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表3。

表3 马兜铃酸A的加样回收率试验结果（n＝3）Tab 3 Resultsof recovery testsof aristolochic acid A（n＝3）

2.3.5 样品含量测定 取各批天钻药材粉末约0.5 g，分别按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，计算样品中马兜铃酸A的含量，结果见表4。

表4 各批天钻药材中马兜铃酸A的含量测定结果（%，n＝3）Tab 4 Results of content determ ination of aristolochic acid A in A.kwangsiensis（%，n＝3）

3 讨论

文献中用于马兜铃酸A含量测定的检测波长有387、304、260 nm[7-9]，笔者通过对天钻药材的色谱图进行比较后，确定检测波长为260 nm。后又对色谱柱、流动相进行了筛选，最终确定文中色谱条件，且分离效果较好。

关于天钻中化学成分的研究较少，均完成于20世纪90年代以前，其有效成分至今尚未明确。本研究中，笔者选择天钻中含有肾毒性成分的马兜铃酸A作为指标进行含量测定，目的在于提示在天钻使用过程中应注意用药的安全性。本研究发现，购买的天钻药材中马兜铃酸A的质量分数均小于千分之一，这是否因放置时间太长或是受地域因素的影响，值得进一步研究。

综上所述，所建标准可用于天钻药材的质量控制。

[1] 戴斌.中国现代瑶药[M].南宁：广西科学技术出版社，2009：79-81.

[2] 周法兴，梁培瑜，瞿赐荆，等.广西马兜铃的化学成分研究[J].药学学报，1981，16（8）：638.

[3] 广西医药研究所化学室.圆叶马兜铃等三种中草药的镇痛有效部位研究[J].中草药通讯，1977，8（17）：39.

[4] 广西医药研究所化学室.圆叶马兜铃等三种中草药的镇痛实验和临床观察小结[J].中草药通讯，1977，8（10）：30.

[5] 洪庚辛，韦宝伟，贾文才，等.圆叶马兜铃总生物碱镇痛作用机制的研究[J].中国中药杂志，1985，10（1）：38.

[6] 苟蓉，周莉，刘芳.马兜铃酸肾病发病机制的研究进展[J].中国中西医结合杂志，2010，30（2）：215.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录34、附录52、附录53、附录62.

[8] 雷沛霖，李娆娆，黄兰岚.芫花药材质量标准研究[J].药物分析杂志，2008，28（5）：834.

[9] 沈洁，徐向辉，徐军.贝芩新咳合剂的质量标准研究[J].中国药房，2013，24（31）：2 939.

Quality Study of Yao M edicineAristolochia kwangsiensis

ZHANG Ya-zhou1，2，FAN Lan-lan1，QIN Shan-ding1，LIDian-peng2（1.Natural Pharmaceutical Chem istry Center，Guangxi Zhuang Autonomous Region Medicinal Botanical Garden，Nanning 530023，China；2.Guangxi Zhuang Autonomous Region Guilin Botany Institute，Chinese Academy of Sciences，GuangxiGuilin 541006，China）

OBJECTIVE：To establish quality control of Yao medicineAristolochia kwangsiensis.METHODS：The samples were identified by m icroscopic identification and TLC；according to the method ofChinese Pharmacopoeia，moisture，total ash，acid-insoluble ash and extract were detected；the content of aristolochic acid was determ ined by HPLC.The separation was performed on Phenomenex Gem ini C18（250 mm×4.6 mm，5μm）column w ith mobile phase consisted of acetonitrile-water（containing 0.34%triethylam ine，0.94%acetic acid，gradient elution）at detection wavelength of 260 nm.RESULTS：M icroscopic characteristics ofA.kwangsiensiswere distinctive；TLC spots were clear；the linear range of aristolochic acid A were 1.703-109.000μg/m l（r＝0.999 9）w ith average recoveries of 97.54%（RSD＝0.22%，n＝3），101.16%（RSD＝0.63%，n＝3）and 101.15%（RSD＝0.39%，n＝3）.CONCLUSIONS：Established standard can be used for quality control ofA.kwangsiensis.The m icroscopy and appearance of 11 batches ofA.kwangsiensisfrom Guangxi and Yunnan province have kept stable，but there is great difference in the content of aristolochic acid A.

Aristolochia kwangsiensis；Aristolochic acid A；Quality standards；Yaomedicine

R284.1；R917

A

1001-0408（2014）11-1034-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.11.26

广西食品药品监督管理局瑶族习用药材质量评价与标准研究项目（No.MZY2012009）