响应曲面法优化酶解提取玉米黄色素工艺参数

2014-01-31钟振声高怡然

食品研究与开发 2014年13期

钟振声，高怡然

（华南理工大学化学与化工学院，广东广州510640）

玉米蛋白粉俗称黄粉子，是玉米淀粉加工过程中的副产品，呈淡黄色，其蛋白质含量较高，含少量碳水化合物、脂肪和灰分，还含有一定量的玉米黄色素[1-2]，随着我国玉米深加工业的发展，玉米蛋白粉的产出量也在逐年增加，预计2009年可达400 万t 以上，资源量相当可观。但目前我国绝大多数企业仅将玉米蛋白粉作为饲料利用，附加值很低，若能利用玉米蛋白粉进一步开发高附加值产品，则可大幅度提高玉米深加工企业的经济效益，延长玉米产业链，促进玉米经济的发展[2-3]。

玉米黄色素是一种天然食用色素，属异戊二烯类，主要由玉米黄素（3，3′-二羟基-β-胡萝卜素）、隐黄素（3-羟基-β-胡萝卜素）及叶黄素（3，3′-二羟基-α-胡萝卜素）等组成，其中玉米黄素是黄玉米所含的主要色素，这些组分均为类胡萝卜素的混合物[4]。玉米黄色素可用于人造黄油，人造奶油等食品中，其着色效果良好，产品质量稳定。近年来还发现玉米黄色素具有不可多得的营养保健功效，因此在食品、饮料、医药行业有着广泛的应用前景[5-6]。

玉米黄色素的提取，一般是利用有机溶剂如石油醚，丙酮，已烷，乙醇等对玉米蛋白粉进行萃取，并经过浓缩而获得色素制品[7]。据文献可知，玉米黄色素在玉米蛋白粉中通常与蛋白结合呈络合物的状态存在，如果单纯用溶剂浸提，得到的玉米黄色素量较少[8-10]。

本研究采用蛋白酶作为辅助，以无水乙醇浸提玉米蛋白粉提取玉米黄色素。在提取过程中，影响提取效率的因素很多，本文运用响应面法[11-13]优化酶解辅助提取玉米黄色素的工艺参数，力图提高黄色素的提取率。响应面法是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素和响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法，可以快速有效地确定多因子系统的最佳条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米蛋白粉：工业品；中性蛋白酶：购于北京鼎国生物科技有限公司；无水乙醇为分析纯试剂。

752-P 紫外-可见分光光度计：上海现科仪器有限公司；SHZ-82A 空气摇床：常州奥华仪器有限公司；TGL-16gR 冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；pHS-25型精密pH 计：上海精科仪器厂；U3010 紫外-可见分光光度计：日本HITACHI 公司。

1.2 方法

1.2.1 溶剂选择及最大吸收波长的确定

称取2.0 g 玉米蛋白粉，加入20 mL 溶剂，室温浸提1.5 h，抽滤。取滤液于400 nm～500 nm 波长进行波谱扫描，绘制波长-吸光度曲线。测出色素吸收峰所对应的最大吸收波长后，在此波长下测定不同条件提取出来的色素的吸光度。

1.2.2 玉米黄色素的提取

取25 g 玉米蛋白粉，加约400 mL 蒸馏水，调pH 7.0，加入1 mL 中性蛋白酶，40 ℃下水解2 h，离心残渣于40 ℃烘箱热风干燥。分别取玉米蛋白粉2.0 g 于5 个三角烧瓶中，分别加入20 mL 无水乙醇，然后置于45 ℃恒温水浴中，分别浸提1、2、3、4、5 h。浸提液定容至100 mL，测定其吸光度。

1.2.3 玉米黄色素提取率的测定

采用 AACC（American Association of Cereal Chemists）法[14]，用总胡萝卜素的含量表达样品中黄色素的有效含量。准确称取样品0.6 g，加入40 mL 水饱和丁醇溶液，浸提3 h，并不时轻轻振荡。用滤纸过滤得上清液，用紫外-可见分光光度计在445 nm 处测吸光度。以提取物吸光度/玉米黄粉吸光度来表达提取率。测得玉米黄粉吸光度为0.710。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

按照1.2.1 的方法，用无水乙醇作为提取溶剂，测定玉米黄色素的波长-吸光度曲线如图1 所示。

可见其最大吸收波长为445 nm。以下实验均为在此波长下的吸光度值。

2.2 蛋白酶水解的单因素试验

图1 玉米黄色素的波长-吸光度曲线Fig.1 Wavelength-absorbance curve of yellow pigment

据文献报道，类胡萝卜素在40 ℃以下较稳定[15]，45 ℃时玉米蛋白粉中的游离玉米黄色素受到温度的影响可能损失从而降低得率。本实验使用的中性蛋白酶的最适宜温度为40 ℃左右。鉴于这两点考虑，确定本实验的水解温度为38 ℃。中性蛋白酶的最适pH 为6～7，在这个范围里的pH 对玉米黄色素提取效率影响不大，故确定水解试验pH7.0。

2.2.1 水解时间的影响

分别取5 g 玉米蛋白粉，使其底物浓度为3%，酶浓度为1%，pH7.0，38 ℃下水解，结果见图2。

图2 水解时间对玉米黄色素提取效率的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time on the extraction of yellow pigment

吸光度变化比较大的水解时间段为4 h～8 h，因此，选择4、6、8 h 3 个水平做以下Box-Behnken 实验。

2.2.2 底物浓度的影响

分别取5 g 玉米蛋白粉，使其酶浓度为1%，pH 7.0，38 ℃下水解6 h，结果见图3。

图3 底物浓度对玉米黄色素提取效率的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on the extraction of yellow pigment

吸光度变化比较大的底物浓度范围为3%～7%，因此，选择底物浓度3%，5%，7 % 3 个水平做以下Box-Behnken 实验。

2.2.3 酶浓度的影响

分别取5 g 玉米蛋白粉，使其底物浓度为5%，pH 7.0，38 ℃下水解6 h，结果见图4。

图4 酶浓度对玉米黄色素提取效率的影响Fig.4 Effect of enzyme concentration on the extraction of yellow pigment

吸光度变化比较大的酶浓度范围为2.2 %～3 %，故选择酶浓度2.2%，2.6%，3%3 个水平做以下Box-Behnken 实验。

2.3 响应面法优化蛋白酶水解过程

2.3.1 试验设计及结果

三水平三因素的响应面分析实验。共有15 个试验点，其中12 个位析因点，3 个位零点以估计误差。因素水平见表1，试验结果如表2。

表1 Box-Behnken 实验因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

表2 Box-Behnken 实验设计表及其试验结果Table 2 Results analysis of Box-Behnken experiment

将以上试验结果用Design-Expert 软件进行数据分析，分析结果拟合得到响应值A445 和各因子（X1：水解时间；X2：底物浓度；X3：酶浓度）的回归方程为：

提取率= -52.983 01-7.509 54X1-17.159 57X2+146.62338X3-0.46377X1X2+1.42699X1X3+13.4375X2X3+0.668 90X12-1.447 80X22-43.33X32

2.3.2 响应面结果分析

响应面的回归系数分析见表3，方差分析结果见表4。

表3 二次多项式回归系数Table 3 Regression coefficients of quadratic polynomial

表4 响应曲面二次回归方程模型方差分析结果Table 4 ANOVA results of quadratic response surface regression model

从表4 可知，该二次回归模型显著（p=0.004 5＜0.05），失拟项不显著（p=0.384 5），说明该模型和试验拟合良好，可用于酶解提取玉米黄色素试验的分析和预测。模型的可信度分析见表5。

表5 模型的可信度分析Table 5 Reliability analysis of model

其中信噪比为12.220＞4，可知回归方程拟合度和可信度均较高，试验误差较小。

根据回归方程做响应面，考察拟合的响应面的形状，分析水解时间、底物浓度和酶浓度对玉米黄色素的提取率，其响应面如图5、图6 和图7 所示。

图5 水解时间，底物浓度及其交互作用对玉米黄色素提取率的影响和等高线Fig.5 Effects of hydrolysis time，substrate concentration and interaction on the extraction of yellow pigment and contour line

图6 水解时间，酶浓度及其交互作用对玉米黄色素提取率的影响和等高线Fig.6 Effects of hydrolysis time，enzyme concentration and interaction on the extraction of yellow pigment and contour line

图7 酶浓度，底物浓度及其交互作用对玉米黄色素提取率的影响和等高线Fig.7 Effects of enzyme concentration，substrate concentration and interaction on the extraction of yellow pigment and contour line

图5 表示水解时间和底物浓度对提取率的交互作用情况，由图5 中等高线图可知，等高线沿水解时间方向变化相对密集，说明水解时间对响应值的影响比底物浓度大；图6 表示水解时间和酶浓度对提取率的交互作用情况，图6 中，等高线沿酶浓度方向变化相对密集，说明酶浓度对响应值的影响比水解时间大；由图7 可知，等高线密度沿酶浓度和底物浓度方向相当，可知对响应值的影响相当。

3 结论

本研究采用响应面分析法优化酶解辅助乙醇提取玉米黄色素的工艺，以水解时间、底物浓度、酶浓度为主要因素进行Box Behnken 试验，建立了玉米黄色素提取率的回归方程为

提取率= －52.983 01－7.509 54X1－17.159 57X2+146.623 38X3－0.463 77X1X2+1.426 99X1X3+13.437 5X2X3+0.668 90X12－1.447 80X22－43.33X32

试验结果表明，当提取工艺中水解时间为8 h，底物浓度为4.48 %，酶浓度为2.52 %时提取率达到81.053%，与Design expert 软件预测的81.996%仅相差1.15%，说明该模型可靠。在各影响因子中，水解时间对响应值的影响比底物浓度大，酶浓度对响应值的影响比水解时间大，酶浓度和底物浓度对响应值的影响相当。

经过用响应面法优化酶法辅助提取玉米黄色素，提取率比传统的乙醇提取法（提取率16.125%）提高了5 倍。

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