大理野生橄榄多糖、总黄酮和总多酚的含量测定

罗永会，张翠香，徐春萍

（大理学院基础医学院生物化学与分子生物学实验室，云南大理671000）

大理野生橄榄属滇橄榄（Phyllanthus emblica L.），是大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属（Phyllanthus）植物余甘子（Phyllanthus emblica L.）的果实。在大理野生橄榄果实以常生食或盐渍后食用，入口酸甜微涩，回味甘甜，故名余甘，又名喉甘子，庵罗果，牛甘果等。余甘子含有丰富的多糖及维生素、氨基酸、超氧化物歧化酶（SOD）及多酚类物质等活性物质和人体必需的微量元素等[1]。橄榄药用价值丰富，为我国传统中药材，具有清热凉血、消食健胃和生津止咳、抗肿瘤、延缓衰老、增强心血管功能、治疗慢性前列腺炎、增强免疫力、调节内分泌系统、护肝、抗炎、抗过敏、抑菌、抗病毒等功效[2]。主要用于治疗发热咳嗽、烦热口干、消化不良、慢性肝炎、肥胖、高脂血症，是卫生部公布的“药食同源”品种之一，也是联合国卫生组织指定为世界推广种植的3 种保健植物之一[3-6]。本文以大理丰富的野生橄榄为原料，通过实验提取并测定大理野生橄榄果实中的可溶性多糖、黄酮及多酚类化合物的含量，以期为大理野生橄榄的开发应用提供参考数据。

1 仪器和材料

1．1 材料和试剂

新鲜野生橄榄购于云南大理市农贸市场，产于云南省大理苍山。

芦丁（国药集团）、葡萄糖、没食子酸、石油醚（沸程60 ℃～90 ℃）、无水乙醇、浓硫酸、苯酚（洛阳市化学试剂厂生产），均为分析纯。

1.2 主要仪器

BT-224S 型电子分析天：德国赛多利斯仪器公司；HH－4 数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；TDL－4A 低速离心机：上海菲恰尔仪器有限公司；722E分光光度计：上海分析仪器有限公司；RA－6000 旋转蒸了仪：上海亚荣生化仪器厂；中药粉碎机。

2 方法

2.1 样品处理

野生橄榄洗净，去核，60 ℃干燥24 h，粉碎。称取100 g 野生橄榄粉，加入10 倍体积的石油醚，65 ℃水浴回流2 h，重复2 次，脱脂及去除色素，室温挥干有机溶剂，干燥得脱脂野生橄榄样品，备用。

2.2 待测样品的制备

精确称取0.500 g 脱脂橄榄样品置于250 mL 三角烧瓶中，加入100 mL 去离子水或60%乙醇，用保鲜膜封紧瓶口，置于沸水浴或置于40 ℃水浴（加入60%乙醇则置于40 ℃水浴）浸提2 h～3 h，过滤，重复1 次，合并滤液得待测样品溶液。

2.3 大理野生橄榄多糖的测定

2.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制

葡萄糖105℃干燥至恒重，称取10.0 mg，用去离子水定容至100.0 mL，则葡萄糖标准液浓度为0.1mg/mL。准确吸取对照品溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 的葡萄糖标准液，分别加水至2.0 mL，各加1.0 mL 5%苯酚溶液，混匀，再加5.0 mL 浓硫酸，放置5 min，置于沸水浴中加热15 min，冷至室温，以第1 管为空白，于490 nm 处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[7]。

2.3.2 样品中多糖的测定

取1.0 mL 待测样品，参照2.3.1 方法操作测定490 nm 处吸光度，代入线性回归方程，求出样品多糖的浓度，计算橄榄中多糖含量：

式中：C 为样品中多糖的浓度，根据标准曲线算出；V 为样品稀释后的体积；m 为样品的质量。

2.4 野生橄榄总黄酮的测定

2.4.1 芦丁标准曲线的绘制

精确称取120 ℃干燥恒重的芦丁标准品52.8 mg，用60%乙醇定容至100 mL，则芦丁标准液的浓度为0.528 mg/mL 准确吸取对照品溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，分别加60%乙醇至2.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，放置6 min，加10%的硝酸铝溶液0.3 mL摇匀，放置6min 后加5%的氢氧化钠溶液2.0 mL，混匀，放置15 min 加60%乙醇至10.0 mL，以第1 管为空白对照，于510 nm 处读取吸光度，以芦丁浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线[8]。

2.4.2 样品中总黄酮的测定

精密吸取1.0 mL 待测样品参照2.4.1 方法，配制样品液，于510 nm 处读取吸光度，代入线性回归方程，救出样品黄酮浓度，计算橄榄中总黄酮的含量：

式中：C 为样品中黄酮的浓度，根据标准曲线算出；V 为样品稀释后的体积；m 为样品的质量。

2.5 野生橄榄总多酚的测定

2.5.1 没食子酸标准曲线的绘制

精确称取10.00 mg 没食子酸标准品，用去离子水定容至100 mL，则没食子酸标准液浓度为0.1 mg/mL。准确吸取对照品溶液0.0、0.7、1.4、2.1、2.8、3.5 mL，分别加去离子水至5.0 mL，混匀，加入3.0 mL 酒石酸铁溶液，加磷酸缓冲液至10.0 mL 混匀，以第1 管为空白对照，于540 nm 处读取吸光度，以没食子酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线[9]。

2.5.2 橄榄总多酚的测定

精密吸取1.0 mL 待测样品参照2.5.1 方法，配制样品液，于540 nm 处读取吸光度，代入线性回归方程，救出样品多酚浓度，计算橄榄中总多酚的含量：

式中：C 为样品中多酚的浓度，根据标准曲线算出；V 为样品稀释后的体积；m 为样品的质量。

3 结果分析

3.1 对照品标准曲线

3.1.1 葡萄糖对照品标准曲线

用苯酚－硫酸法测定吸光度，并以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为：y=0.014 6x+0.039 4（R2=0.998 2），葡萄糖浓度在：20 μg～100μg 范围内标准曲线呈良好线性关系如图1。

图1 葡萄糖标准线（490 nm）Fig.1 Standard curve of glucose（490 nm）

3.1.2 芦丁对照品标准曲线

采用NaNO2-AINO3-NaOH 法测定吸光度，并以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为：y=0.010 8x+0.005 9（R2=0.999 8），芦丁浓度在：20 μg～105 μg 范围内标准曲线呈良好线性关系如图2。

图2 芦丁标准线（510 nm）Fig.2 Standard curre of rntin（510 nm）

3.1.3 焦性没食子酸标准曲线

采用洒石亚铁法测定吸光度，并以焦性没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为：y=0.016 6x+0.017 6（R2=0.998 5），焦性没食子酸浓度在：14 μg～70 μg 范围内标准曲线呈良好线性关系如图3。

图3 没食子酸标准线（540 nm）Fig.3 Standard curre of pyrogallic acid（540 nm）

3.2 大理野生橄榄中多糖及总黄酮和总多酚含量

本实验分别用去离子水沸水浴和60%乙醇40 ℃水浴浸提2 h～3h，以葡萄糖、芦丁及焦性没食子酸作为对照品，分别采用苯酚－硫酸法，NaNO2-AlNO3-NaOH 法，洒石亚铁法测定大理野生橄榄中多糖、总黄酮及总多酚的含量如表1。

表1 大理野生橄榄中多糖及总黄酮和总多酚的含量（n=5）Table 1 Content of the soluble polysaccharide，flavone and polyphenol in Dali in the wild olive（n=5）

由表1 得大理野生橄榄中含有丰富的多酚、多糖及黄酮类物质，用60%乙醇浸提总含量可达（8.98±0.133）%，而用去离子水浸提总含量高达（8.98±0.13）%，其中多酚含量较高，用60 %乙醇浸提高达（5.43±0.232）%，而用去离子水浸提也可达（5.19±0.114）%以上，见图4。

图4 橄榄多糖、总黄酮、总多酚的含量与浸提剂的关系图Fig.4 The content of total polyphenolsolive polysaccharide total fcavonoids and leaching agent relationship

4 讨论

本实验分别以葡萄糖、芦丁和焦性没食子酸为对照品用苯酚-硫酸法、NaNO2-AlNO3-NaOH 法，洒石亚铁法分别测定大理野生橄榄中多糖，总黄酮和总多酚的含量，方法快捷、简单，稳定并且在一定范围内线性关系良好。用去离子水沸水浴浸提测得大理野生橄榄中多糖，总黄酮和总多酚含量分别为：（3.02±0.105）%、（0.78±0.081）%、（5.19±0.114）%；而用60%乙醇40 ℃水浴浸提测得大理野生橄榄中多糖，总黄酮和总多酚含量分别为：（2.38±0.675）%、（0.58±0.074）%、（5.43±0.232）%。结果表明大理野生橄榄含有丰富的抗氧化成分多糖、黄酮和多酚类物质，是一种药食同源的绿色食品。且多糖和黄酮的提取用水优于用乙醇，而总多酚的提取用乙醇较好。 有关大理野生橄榄多糖、黄酮及总多酚的提取及生物活性有待进一步研究。

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