有机磷农药降解酶的研究进展
2014-01-31孙嘉郎朗
孙嘉 郎朗
(哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心 黑龙江哈尔滨 150076)
在我国,有机磷农药占所有使用农药的80%以上[1],由于有机磷农药的不合理使用,近年来有机磷农药残留问题和中毒事件日益增加。因此,研究有机磷农药降解方法成为当前热点问题之一。随着生物技术的不断发展,微生物对有机磷农药的降解作用得到了人们的充分肯定,酶促反应是微生物降解法的主要形式之一。
1.1 氧化降解法
化学氧化降解法是通过化学反应将有机磷农药中的有毒物质的毒性降低或消除,从而达到处理的目的。常用的氧化剂有过氧化氢、过碳酸钠、铈配合物等。H2O2降解农药时常与Fe3+或Fe2+组成Fenton,通过氧化还反应处理农药污染物。H2O2在反应过程中生成无污染的水和氧气,且不改变废水的pH,投入过量时也不会产生二次污染。但Fenton的降解率随pH的升高而降低,易受pH条件影响。过碳酸钠作为一种新型氧化剂,溶于水之后pH增加,可促进降解进行,处理过程中通过水解产生溶解氧达到降解有机磷农药的目的。但由于过碳酸钠溶于水后易分解,所以增加其用量与延长降解时间不能有效提升降解率。利用铈配合物能切断有机磷农药中的磷脂键原理,从而达到有机磷农药降解作用。但铈配合物对有机磷农药的降解有一定的选择性,且体内的理化反应体系复杂,并受诸多环境因子影响,所以铈配合物降解法并不能广泛适用。
1.2 光催化降解法
光催化法常与催化剂TiO2结合对污染物进行作用,但TiO2光催化降解有机磷农药只有在光照、光催化剂和氧气同时存在的条件下才能产生作用,降解率随三种影响因素的用量的增加而增大,达到最佳效果后,降解率随用量的继续增大反而降低。为延长电子与空穴的复合时间,常将少量的特定金属离子与TiO2混合,从而提高光催化性,此时金属离子又会产生二次污染。因此TiO2光催化法受环境因素制约较大,而且易产生二次污染,并不适宜广泛应用。
1.3 生物降解法
随着生物技术的不断发展,微生物降解有机磷农药技术得到充分肯定。许多有机磷农药的降解菌已被分离出来,其中一些微生物的有机磷降解酶的生化性质已得到鉴定,少数有机磷农药降解基因已得到分离、鉴定、改造。降解酶往往比生产这类酶的原菌体微生物对环境的适应性更强。如对硫磷水解酶,在22℃时该酶的降解效率比化学降解快1000~2450倍,且比产生该酶的微生物菌体对环境条件的忍受范围更大,在较高温度下亦能保持较高的活性,而该酶的生产菌在相同条件下却不能生长[2]。用微生物或其降解酶制品来消减农药污染的生物降解法显出广阔的应用前景。
2 有机磷农药降解酶的研究进展
2.1 有机磷农药降解酶的作用机理
有机磷农药降解酶主要是水解酶类。有机磷降解酶通过切断有毒物质中表达毒性的、不溶于水的大分子的分子键(例如:P-O键、P-F键、P-S键、P-CN键),使之成为无毒的、溶于水的小分子。由于不同有机磷农药的取代基不同,因此一种有机磷降解酶往往能降解多种有机磷农药。
2.2 有机磷农药降解酶的研究进展
早在70年代人类就发现有些土壤中的某些微生物对农药具有降解作用。Munneck等[2]从假单胞杆菌中检测出磷酸酯酶的活性,发现其对对硫磷等7中有机磷农药均具有降解作用。Defrank等[3]等从一株嗜盐细菌中提取出一种有机磷农药降解酶,可被Mg2+和Co2+激活。Cheng等[4]从单胞菌中纯化得到一种有机磷农药降解酶,最佳pH为8.0,最适温度为55℃,对含P-F键和P-C键的有机磷化合物作用较好。
近年来,我国对有机磷降解酶也做了多方面研究。刘玉焕等[5]从曲霉菌中分离纯化出有机磷农药降解酶,此酶对有机磷农药乐果具有较好降解作用,酶活性范围在pH6~10之间;重金属、Cu2+对该酶具有促进作用,而SDS对其有抑制作用。金彬明等[6]从海洋微生物M-1中分离纯化出有机磷降解酶,最适反应温度30℃,最适 pH7.5,K+、Na+、Ca2+、Mn2+等离子对酶活性有促进作用;Hg2+、Zn2+、Cu2+等离子对酶活性有抑制作用。
有机磷降解酶在天然菌株中的含量太低,要将其普遍应用于农业生产中,解决有机磷降解酶廉价、大量生产成为推广有机磷降解酶制剂的首要难题。随着分子生物技术和基因技术的发展,人们试图通过构建高效反应器来提高酶的表达量,为其大规模生产奠定了基础。
2.3 有机磷农药降解酶基因工程的研究
多种有机磷降解酶不断从各种微生物中提取出来,人们对有机磷降解酶的基因表达和克隆研究也取得了新的进展。Serdar等[7]首次在大肠杆菌中表达有机磷降解酶,发现其产物具有生物活性,但表达量未见提高,而后又改变此酶的基因序列及信号肽编码序列后在大肠杆菌中表达,使之表达量有所提高。
经过多年的科学研究,有机磷降解酶的基因表达和克隆得到显著成效。邓敏捷等将有机磷水解酶基因与载体pET-31a重组,在E.coliBL21中得到成功表达,经诱导4小时后,重组蛋白的酶活性是原菌的10倍[8]。刘智等[9]通过鸟枪法克隆甲基对硫磷水解酶基因在大肠杆菌中表达,及构建能同时降解多种有机农药的降解菌,使其降解酶在实验室条件下活性提高6倍。
可见,有机磷降解酶的基因表达和克隆可有效增强有机磷降解酶的生物活性,有研究表明将酶定位在细胞表面,更能提高反应效率。这表明在此后的研究中,有机磷降解酶的基因水平研究将会成为有机磷农药降解领域的主要发展方向之一。
3 有机磷农药降解酶的应用
3.1 固定化酶用于有机磷污染物脱毒
固定化有机磷酶制剂制成酶反应器现已用于污水处理中,有机磷酶制剂不仅可以重复利用,在恶劣条件下保持其生物活性,还不易造成二次污染,在土壤修复中可避免土壤吸附、失活。因此有机磷降解酶在环境科学与生物传感技术上能得到广泛应用。
3.2 生物传感器用于检测有机磷化合物
有机磷降解酶可水解出多种有机磷化合物,可释放出容易检测的硝基酚、氟化物或氢离子,国外基于此种特性已研制出光学、电势计和安培计生物传感器,可快速准确的检测出有
3.3 医疗中用于制备有机磷中毒的解毒剂和抑制剂
有机磷神经毒剂中含有磷酸三酯键,磷酸三酯键断裂后,其毒性会大大降低。有机磷降解酶可切断含磷键,所以利用其作用机理也可研制有机磷解毒剂与预防剂,从而应用于医学领域。
4 展望
目前国内外对有机磷降解微生物及其纯化的降解酶已有广泛研究,将有机磷降解酶有效的应用于实际生产中将成为首要问题。未来的研究方向从多个角度出发:进一步从微生物中纯化出可实际应用的有机磷降解酶、根据分子生物学进行鉴定从而建立菌种库、加强有机磷降解酶的活化性质研究,从而真正将有机磷降解酶应用于生产生活中、体用细胞工程,基因工程等技术提高酶的活性、从酶的适应性强等多优势出发,有效的将有机磷降解酶应用于更多领域。
[1].张婵,廖晓兰.有机磷农药的微生物降解技术研究进展[J].广西农业科学学报,2010,41(10):1079-108210.
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[4].Cheng,TC,Harvey SP,Stroup AN.Purification and propertiesofa highly active organophosphorus acid anhydrolase from Alteromonas undina[J].Appl.Environ.Microbiol,1993,59:3138-3140.
[5].刘玉焕,钟英长.华丽曲霉Z58有机磷农药降解酶的纯化和性质[J].微生物学报,2000,40(4):430-434.
[6].金彬明,文性明.海洋微生物有机磷降解酶的纯化与性质研究[J].中国微生态学杂志,2007,19(1):37-39.
[7].Serdar,C M,Murdock D C,Rohde M F.Parathion hydrolasegene from Pseudomonas diminuta MG:subcloning,complete nucleotide sequence,and expression of themature portion of the enzyme in Escherichia coli[J].Bio/Technology,1989,7:1151-1155.
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[9].刘智,洪青,徐剑宏,等.甲基对硫磷水解酶基因的克隆与融合表达[J].遗传学报,2003,9(11):1020-1026.