特异性生物芯片在乳品检测中的应用

穆小婷，董文宾，王玲玲，修秀红

(1.陕西科技大学 生命科学与工程学院，西安 710021；2.山东福田药业有限公司，山东 禹城 251200)

0 引 言

乳及乳制品中所含各种营养元素与人体营养需求相似，易于消化吸收，是人们日常不可缺少的营养品之一，但是近年来乳品掺假现象屡禁不止，所以急需寻找一种新型、高效、准确的乳品安全检测分析技术。生物芯片技术是20世纪90年代初期发展起来的一种全新的微量分析技术，利用微电子、微机械、化学、物理以及计算机技术，将生命科学研究中的样品检测、分析过程实现连续化、集成化、微型化，其效率是传统检测手段的成百上千倍[1]。生物芯片包含的种类较多，主要有基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片、微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等，其中基因芯片是生物芯片技术中发展最成熟以及最先进入应用和实现商品化的领域，芯片实验室是集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体，实现生化分析全过程，是生物芯片发展的最高阶段[2-5]。

1 特异性生物芯片技术在乳品检测中的应用

目前生物芯片技术已广泛应用于生命科学、医药卫生等领域，乳及乳制品中成分含量非常复杂，所以有效地将生物芯片应用于牛乳的检测，将对未来乳品行业的发展产生不可阻挡的动力。文章针对目前国内外利用特异性生物芯片检测乳及乳制品的应用情况进行了全面综述，包括在致病微生物、抗生素、毒素、药物残留、转基因食品及其他方面的应用。

1.1 特异性生物芯片技术在致病微生物检测方面的应用

牛奶中微生物的含量是评价牛奶质量的一个重要指标,对最终产品质量起着关键性的作用。传统的致病微生物检测方法主要有平板计数法和显微镜直接观察法等，它们不仅周期长、操作繁琐，且灵敏度不高，使得食品的安全检测存在一定的危险，给消费者带来威胁，现代技术用的比较多的PCR法比前者快速、灵敏，但成本高，假阳性多，也不是很好的检测食品微生物污染的方法。而生物芯片技术由于其具有高通量、高灵敏度和高特异性等优点，可以及时反映食品中微生物的污染情况，获得了人们的广泛青睐，它可应用于各种导致食品腐败的致病菌的检测,能及时、快速、准确地反映乳品中微生物的污染情况。

近年来，越来越多的研究者开始用生物芯片技术对食品中常见致病菌进行检测，Cremonesi等[6]根据连接酶检测反应设计了一种新的DNA芯片，直接从乳样品中鉴定能引起牛羊的乳房炎或引起食品中毒的15种细菌：金黄色葡萄球菌、无乳链球菌等，并对50个乳样品迸行了验证，结果显示出高特异性，灵敏度达到6 fmol。

YANG L[7]试验了将双向电泳和固定化生物芯片结合使用来检测食源性致病菌，最终证明，这俩种方法的结合可大大提高生物芯片的免疫捕捉能力和检测效率。

我国国家生物芯片中心等单位已开发并生产食源性致病菌检测、食源性病毒检测的生物芯片技术平台仪器和试剂盒[8]。相信不久的将来，芯片技术将越来越多地进入乳品类食品病原菌检测技术领域，实现检测系统的集成化、一体化。

奶牛乳房炎是奶牛三大疾病之一，会严重降低奶牛产奶量和乳品质量，而病原微生物感染是奶牛乳房炎常见的病因，据大量文献报道，金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌为引起奶牛乳房炎的主要病原菌。韩旭等[9]全面综述了PCR、基因芯片和环介导等温扩增技术在奶牛乳房炎主要病原菌诊断中的应用。邢会杰等[10]建立了奶牛乳房炎无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌5种主要致病菌的基因芯片检测方法，结果显示芯片检测特异性高、检测的灵敏度为103CFU/mL。

1.2 特异性生物芯片技术在抗生素检测方面的应用

抗生素残留不仅影响乳及乳制品的品质，而且还会降低产量及破坏后期产品风味，给生产者造成经济损失，且会对人体造成极大的伤害。自2006年7月起国家规定对所有生鲜牛奶强制检测抗生素含量，超标者不可出售[11]。目前对抗生素的检测方法主要有理化检测法，微生物检测法和免疫检测法等，仪器检测法虽然灵敏，但检测费用高，很难普及使用，传统的微生物检测方法费用低，一般实验室都能操作，但时间长、易产生误差、操作复杂。

Knecht等[12]利用硅烷化修饰的片基制备抗原点阵，自动化分析牛奶中10种抗生素含量，包括β-内酰胺类、磺胺类和氨基糖苷类，整个检测过程自动化，单个组分检测所用时间不到5 min，10种组分的检测线在0.12～32 ug之间。

Kloth等[13]建立的间接竞争化学发光免疫芯片法，可在几分钟内同时检测牛奶中13种抗生素的含量。他们对片基采取了多步化学处理后，最终在玻片表面修饰上环氧树脂活化的PEG层，然后加入磺胺类、β-内酰胺类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类等的衍生物，直接与环氧树脂进行共价结合，无需再加其他偶联剂。该方法灵敏度较高，且可重复使用50次，增加了测定的稳定性和便捷性，且减少重新制备片基。

Bang-Ce Y等[14]报道了利用间接竞争荧光免疫蛋白芯片法同时测定牛奶中磺胺二甲嘧啶、链霉素，泰乐菌素的含量。结果显示3种抗生素的检测限分别为：3.26 ng/mL（磺胺二甲氧嘧啶），2.01 ng/mL（链霉素），637 ng/mL（泰乐菌素），均低于各自的最大残留量。并对实际样品牛奶进行了测定，结果取得了较好的加样回收率。

左鹏,叶邦策等[15]利用蛋白芯片法快速测定乳品中氯霉素和磺胺二甲嘧啶残留，并且同现行的免疫学测定方法进行了比较，结果证明利用蛋白芯片竞争法可以快速准确测定动物源性食品中氯霉素磺胺二甲嘧啶的残留。

1.3 特异性生物芯片在毒素检测方面的应用

毒素对人体的健康影响甚大，曾被世界卫生组织列为食源性疾病的重要根源。目前常用的乳及乳制品中毒素的检测方法主要是化学分析方法、仪器法、免疫学方法或这些方法的相互结合等[16]。生物传感技术作为一种全新的微量分析技术,将生物技术和电子技术相结合,从而能够进行生命物质和化学物质检测和监控的装置。

早在1996年，高志贤等[17]便采用压免疫传感器检测牛奶中C型葡萄球菌肠毒素,并用多种方法比较电极再生,所制作的压电免疫传感器简单、灵敏,检测的灵敏度可达到2.5 μg/L。

Strachan等[18]采用自动免疫传感器检测乳酪中的肠毒素等物质，结果证明试验只需要10 min便可出现结果,检测最低限为5 ng/g。

Medina等[19]应用表面质粒共振生物传感器(SPR)检测牛奶样品中的肠毒素B,灵敏度可达到0.5 ng/mL。SPR检测的缺陷是只能同时分析几种物质(少于4种)，不能区分特异的靶物质和芯片表面其他样本的非特异交叉反应物，对于固定的受体,当其发生点突变、化学改变或功能活性改变时,SPR不能将其同完整的分析物加以区分。

1.4 特异性生物芯片技术在药物残留检测方面的应用

乳品中的药物残进入人体对人类的健康构成潜在的威胁，目前多种药物残留可以通过生物芯片技术进行检测，主要包括磺胺二甲基嘧啶、链霉素、恩诺沙星和克伦特罗[20]，具有前处理简单、灵敏度高、特异性好、检测速度快、检测通量高、质控体系严密等优点。

郭志红等[21]应用蛋白芯片技术建立了动物组织中重要兽药(磺胺二甲基嘧啶、恩诺沙星、盐酸克伦特罗和链霉素)的高通量筛选方法，并与酶联免疫吸附试验、气相色谱串联质谱、高效液相色谱和微生物检定法进行了比对，从实验结果可以看出，用蛋白芯片进行兽药残留检测的样品前处理方法简单、速度快，且用同一种方法提取了多种兽药，节省了提取溶剂的用量，在环保方面也有很大的优势。

陈爱亮等[22]根据抗原和抗体特异性结合的免疫学原理，采用荧光标记竞争免疫法，构建蛋白芯片测定样品中的兽药残留含量。同时结合博奥生物有限公司研发的样品分子提取仪、芯片扫描仪以及配套的自动化数据分析软件，开发了晶芯兽药残留蛋白芯片检测系统，该系统可用于猪肉、鸡肉、牛奶中磺胺类物质、链霉素、双氢链霉素、恩诺沙星以及氯霉素的定量检测。

吴长红[23]在“2011年第四届国际食品安全高峰论谈论文集”中也发表了有关生物芯片阵列技术在检测食品中多种残留物的文章，包括乳品中磺胺二甲基嘧啶的检测。

1.5 特异性生物芯片技术在转基因食品方面的应用

自1994年美国第一个转基因植物产品——转基因番茄获得FDA的批准进入市场以来 ,转基因农作物在全球内飞速发展。在乳业中，转基因技术可以从微观的分子水平上认识物质，进行分子操作来生产乳品，这一方面加快了现代乳品加工技术创造性的融合和发展，但由于在新产品中导入了外源基因或改变了原有的基因表达方式，这就涉及到转基因食品的安全性问题，而基因芯片可以检测出食品中是否含有转基因,以及含有何种转基因。目前市场上常用的转基因作物检测方法主要包括PCR检测法、酶联免疫吸附法 、电泳法、波长色散x射线荧光法、各种杂交法和生物测定检测法等，但这些方法大多只能对单个检测目标进行检测，且假阳性高，时间周期长，而基因芯片技术则可以弥补这几方面的不足[24]。

Deisingh等[25]综述了食品中转基因产品的不同检测方法，包括PCR法，生物传感芯片法、商品化试剂盒、电泳法、波长色散x射线荧光法等，芯片法以其高通量、微型化、自动化的特点而占据着显著的优势。乳蛋白量和乳脂量作为奶牛生产重要的经济性状,可直接影响牛奶的营养、风味和牛奶产业的经济效益。南京农业大学张磊[26]选取金华伊康乳业奶牛场内处于干奶期、泌乳前期、泌乳中期以及泌乳后期的中国荷斯坦牛各15头作为研究对象,分析不同泌乳时期的牛基因组表达谱的变化情况，选取与奶牛泌乳过程中密切相关的JAK-STAT信号通路作为研究对象,确定不同泌乳时期该通路内基因表达的变化情况,并根据各基因的生物学功能初步确定与泌乳性状相关的候选基因，从而为生产优质乳品奠定了基础。

1.6 特异性生物芯片技术在其他方面的应用

生物芯片由于其特有的优势，已逐渐应用于乳品检测的各个方面。大家知道牛奶受细菌作用会产生乳酸,而测定牛奶新鲜度的乳酸传感器已成为中国微生物传感器应用的基本品种。另外也可从牛奶放置过程中脂解作用产生的短链脂肪酸的含量来判断牛奶及其制品的新鲜度,这类传感器也己开发出来[27]。另外生物芯片也已应用于食品毒理学评价及营养学评价等，如2008年M.Lefevre等[28]以富含花青素的葡萄为模型，利用基因芯片研究了食品成分与健康食品的作用机理，并提出了3种新的可以检验的关于食品成分和健康食品的作用机理的假说。虽然到现在为止很多研究没有直接针对乳及其制品，但是相信随着生物技术的不断成熟，生物芯片技术必将成为乳及乳制品检测的重要方法之一。

2 展 望

特异性生物芯片技术作为一种新型的生物技术，是一个学科交叉性很强的研究领域，其巨大的潜力和诱人的商业前景是有目共睹的，但由于目前的一些技术难点还没有完全攻破，如由于污染等原因而影响检测的灵敏度、提高生物芯片微阵列的密度、简化样品制备和标记操作等,从而极大限制了市场需求。相信随着各国研究者的不断努力,随着这些技术的进一步完善,基因芯片技术必将成为21世纪最具活力的技术之一，必将受到世界各个国家及其学术界的关注，必将在乳品生产的全程质量控制、构建有效的乳品安全体系等方面发挥更大的作用。

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