乳酸菌的抗冻机制及抗冻能力研究

吴先帆，崔艳华

（哈尔滨工业大学 食品科学与工程学院，哈尔滨150090）

0 引 言

近年来，随着人们对微生物益生作用的认识日益提高，越来越多的乳酸菌被利用于食品和医疗领域中。不同种类的乳酸菌生长在不同的环境条件下，并且广泛分布与自然界中。人类和动物体内、奶制品及一些植物的表面都存在这不同类型的乳酸菌。

低温环境中的乳酸菌在工业生产有着重要的作用，因此研究乳酸菌在低温环境中的抗冻机制，有助于优化乳酸菌发酵剂和发酵乳制品在工业生产中冷冻、发酵和储藏条件，然而人们对于低温环境中的乳酸菌的研究和利用并不充分。本文主要从乳酸菌的生物学特性着手，阐述目前乳酸菌的抗冻机制及其在低温环境中抗冻能力的测定。

1 乳酸菌的抗冻机制

目前，人们对大肠杆菌的冷冻刺激反应及其适应性已有较为深入的研究，而对乳酸菌这方面的研究却很少。乳酸菌在冷冻过程中的生理结构主要发生以下变化：（1）低温环境下，细胞膜的流动性下降；（2）低温环境下，乳酸菌的DNA和RNA二级结构受到影响，从而影响DNA的复制以及转录和翻译的效率[1]。具体论述如下。

1.1 低温诱导合成冷诱导蛋白（CIP）

细菌在低温环境下会发生冷激反应，此时细胞的冷诱导蛋白（Cold-induced protein,CIP）量会增多。冷诱导蛋白的合成主要是通过以下途径改善细胞对低温的适应能力，（1）增加短链或者不饱和脂肪酸的比例进而改善细胞膜的流动性；（2）通过降低负超螺旋，增加DNA超螺旋；（3）提高转录和翻译的效率。

双向电泳分析表明，经过冷刺激后，旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis） CB1、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） 20B、短乳杆菌（Lactobacillus brevis） H12菌株中分别有14个、18个和13个蛋白表达量提高[2]。乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363菌株受到冷刺激后，一些涉及翻译加工、糖代谢、染色体结构和信号转导等相关蛋白被诱导[3,4]。Lactococcus piscium CNCM I-4031菌株在受到冷刺激后一些基础压力蛋白以及糖酵解、脂肪酸合成、能量代谢相关的蛋白表达发生了明显变化，其中包括压力蛋白DbaK、UspA；糖酵解蛋白Fba、GAPDH、Pgk；脂肪酸代谢蛋白FabH、FabF、FabG等等[5]。

冷激蛋白（Cold shock protein,CSP）是重要的冷诱导蛋白，可以作为陪伴分子与RNA通过非特异性相结合，可抑制mRNA二级结构的形成，使低温环境下的转录和翻译得以正常进行[6]。CSP最早在大肠杆菌中被发现，在乳酸菌各个种中也有所发现[7]，并且乳酸菌不同种及其亚种之间的CSP基因数目不尽相同[8]。嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）PB18和CNRZ302菌株中分别含有1个和6个CSPs[9,10]。Bolotin等对乳酸乳球菌乳酸亚种IL1403全基因组序列分析表明其含有2个CSP基因:cspD和cspE[11]。而对乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363的分析，发现该菌含有2对CSP基因 （cspA-cspB和cspC-cspD）、1个单个基因cspE以及一个cspD2，同时发现适量的CSPC可以促进cspB、cspF和cspG基因的表达[3]。 MG1363中的7个CSP基因[3]与同种的IL1403中的2个基因截然不同。同样,植物乳杆菌C3.8菌株中含有2个CSP基因（cspL和cspP）[12]，而植物乳杆菌NC8菌株中，除含有上述两个基因外，还检测出cspC基因[13]。近来在L.piscium CNCM I-4031菌株中也发现了7 ku的CSP蛋白，但是双向电泳研究表明该蛋白并非为冷刺激所诱导[5]。因此，应对某些特定菌株进行特定冷诱导蛋白种类和特性的研究。

此外，冷诱导蛋白的数量、种类及诱导效率与菌株处理或存放的温度和时间也密切相关。20°C下，嗜热链球菌培养2 h和4 h分别合成14个和18个冷诱导蛋白,而在10°C下培养4 h只合成4个冷诱导蛋白[10]。经过转录、核酸杂交技术和2-DE分析表明，MG1363的7个CSP蛋白中有5个 （CspA、CspB、CspC、CspD、CspE）可以被诱导，并且在10°C下的诱导效率最高，而在20°C和4°C下诱导效率最低[14]。与乳酸乳球菌相似，植物乳杆菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌都会有相应的最适的诱导温度。到目前为止，德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌ATCC11842中，仅有1个CSP基因（CspA）被鉴定出。Serror等在42°C下培养德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌时检测出CspA的转录，并发现25°C下其表达达到最大值[15]。低效率的CSPs诱导会使乳酸菌的生长阻滞。因此,即使是同一菌株,其培养温度的改变也会令其冷诱导蛋白的种类和活性发生改变。在工业生产中，测定CSPs诱导的最适温度对于优化是十分重要的。

1.2 脂肪酸的变化

低温对细胞最重要的影响之一，是使细胞膜固有的液态结晶转变为凝胶态，从而导致细胞膜的流动性下降。在冷冻过程中，乳酸菌细胞膜中的脂肪酸会发生改变，不饱和脂肪酸含量增加，而饱和脂肪酸含量下降。由于不饱和脂肪酸的熔点较低，使得在低温下仍能够保持液态，从而在冷冻过程中细胞膜的流动性得以增加。一些脱氢酶类在该变化中起着重要作用，如大肠杆菌中，β-酮酰基酰基载体蛋白合成酶可以将棕榈油酸转化为异油酸[16]。研究表明，L.piscium CNCM I-4031菌株在冷刺激和冷驯化后，一些脂肪酸代谢相关的酶表达量发生明显变化，其中包括β-酮酰基载体蛋白（ACP）合成酶III（FabH），该酶参与II型脂肪酸合成的最初阶段；β-酮脂酰ACP合成酶II（FabF）和β-酮脂酰ACP还原酶（FabG），二者参与脂肪酸伸长率。在冷刺激后，FabH合成量上升，FabF表达量下降；FabG在冷驯化后，表达量下降[5]。Béal等研究表明，增加不饱和脂肪酸的含量，会使嗜热链球菌具有较好的抗冻性[17]。此外，一些特异性脂肪酸对于乳酸菌的抗冷冻性也起着重要作用。Murga等对嗜酸乳杆菌进行冷刺激试验，结果表明C18:2脂肪酸的含量明显增加[18]。在低温条件下,植物乳杆菌中C18:1脂肪酸含量同样有所增加[19]。另外,德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌L2、嗜酸乳杆菌以及瑞士乳杆菌抗冻性能的提高与cycC19:0脂肪酸含量的增加密切相关[20,21]。

环丙烷脂肪酸（Cyclopropane Fatty Acid，CFA）是通过对已整合到磷脂分子的不饱和脂肪酸的后合成修饰形成，即从S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）转移一个甲基基团到不饱和脂肪酸的双键上，形成环丙烷脂肪酸。研究证实，环丙烷脂肪酸有利于提高德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌和旧金山乳杆菌的抗冻能力[20,22]。Zhang等人对Oenococcus oeni的冷冻干燥研究中发现，环丙烷脂肪酸C19cyc11的形成对保护细胞扮演了重要角色[23]。因此，检测不同菌株的抗冻能力，可通过测定脂肪酸的含量及其组成成分来确定。

1.3 核糖体状态的变化

细菌中核糖体对温度具有敏感性[24]，其状态会随着温度变化而发生改变。随着温度的升高，其翻译的速度会大大升高，而带有相应氨基酸的tRNA的提供速度却变化不大，使得核糖体的酰胺基位点空缺。此外，冷刺激使核糖体翻译的效率变低，而在相应酰胺基位点上，由于氨基酰tRNA浓度的增加受到阻碍，进而降低了(p)ppGpp五磷酸鸟苷（鸟苷5’-三磷酸-3’二磷酸）的浓度。升高温度有助于(p)ppGpp的集中，而降低温度则会降低(p)ppGpp的浓度。研究表明，高浓度(p)ppGpp可以降低CSP的表达，而低浓度则会增加CSP的表达[25]。因此，机体对于冷刺激的反应很大程度上受(p)ppGpp的影响。

1.4 核酸的变化

DNA通常为负超螺旋，且易受到温度的影响。其延伸由DNA促旋酶和DNA拓扑异构酶Ⅰ调控。研究表明，细菌在受到冷刺激之后，DNA负超螺旋迅速增加。DNA超螺旋的调节对DNA的复制、转录、重组等功能具有重要作用。一些相关的变化（如碱基对数量的改变）也是由于超螺旋密度的改变而引起的[26]。Mizushima等将大肠杆菌置于6°C低温水浴中培养，提取不同培养时间大肠杆菌的质粒DNA，并用含磷酸氯喹的琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果显示,低温使细胞中质粒DNA负超螺旋增加，但是该反应是短暂的，60 min内DNA高度超螺旋状态就会恢复[27]。

2 乳酸菌抗冻能力的测定

乳酸菌抗冷冻能力，即乳酸菌细胞冷冻储藏于20°C之后恢复其酸化活力的能力。根据乳酸菌抗冻机理，对待选菌株的抗冻能力进行筛选，对工业生产有着重要的意义。

2.1 脂肪酸的测定

可以通过气相色谱法对乳酸菌细胞膜脂肪酸的含量进行快速测定[28]。Wang等对植物乳杆菌和酒明串珠菌进行了研究，首先提取菌体脂肪酸并进行甲基化，然后利用气相色谱进行分析，总结出酒明串珠菌中除主要成分C16:0外，还含有C14:0和C18:0等；而植物乳杆菌中细胞膜脂肪酸的主要成分为C18:1ω-7[29]。嗜酸乳杆菌RD758细胞膜中含有13种脂肪酸，气相色谱分析发现，冷冻后，细菌细胞膜中的脂肪酸种类未发生变化，但是不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例发生了明显变化。15°C下冷冻8 h后，细菌细胞膜中不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例以及cycC19:0相对百分比的变化影响最大[29]。Montanari等人优化了气相色谱方法，成功测定了Lactobacillus helveticus和L.sanfranciscensis中环丙烷脂肪酸的含量。二者受到冷刺激后，环丙烷脂肪酸的含量发生明显变化[22]。

2.2 乳酸脱氢酶的测定

乳酸脱氢酶（LDH）是存在于细胞内参与糖酵解最后一步的一种催化酶。当细胞受损时，LDH会流到培养液中。因此，乳酸菌经过冷冻处理后，可通过测定培养基中LDH的含量，从而得知乳酸菌细胞的受损情况，进而反映出其抗冷冻能力。

通常采用比色法对乳酸脱氢酶进行测定[30]。乳酸与氧化型辅酶Ⅰ（NAD）在LDH催化作用下生成丙酮酸与还原型辅酶Ⅰ（NADH）,丙酮酸再与2，4-二硝基苯肼进行反应生成2，4-二硝基苯腙，而 2，4-二硝基苯腙在碱性溶液中呈棕红色。因此，可通过比色法测定丙酮酸含量，从而推算出LDH的活力。

2.3 酸化活力的测定

酸化活力即乳酸菌发酵乳糖产酸的能力。乳酸菌酸化活力的测定可以采用pH计直接测定。首先待测菌株接种于脱脂乳培养基中，放置于适当温度下进行培养。连续测定样品菌悬液的pH值，直至pH值为5.5时停止，记录培养时间。样品菌悬液pH值下降至5.5所需时间越长，则表示菌的酸化活力越弱。检测冷冻前后酸化活力，通过冷冻后及冷冻前的时间差值，即可看出不同乳酸菌的抗冷冻能力。

3 结束语

低温环境中的乳酸菌是一类非常有应用价值的资源。目前国内外对于低温环境中乳酸菌的抗冻机制的研究并不深入。对于低温环境中的乳酸菌的研究，过去主要集中应用于传统培养。最近几年，许多研究者将分子生态学方法应用于低温乳酸菌的鉴定和分离，使得对这一领域的研究更加深入。随着人们对低温乳酸菌抗冻机制认识的逐步深入，相信这类资源会有广泛的应用前景。

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