多壁碳纳米管抑制RAW264．7巨噬细胞的吞噬功能

李 慧 祝 红 闫 莉 谷婧丽 郝 维 曹济民

碳纳米管由石墨烯片卷曲而成，根据石墨烯片的层数，可以将碳纳米管分为多壁碳纳米管(multiwalled carbon nanotube，MWCNT)和单壁碳纳米管(single-walled carbon nanotube，SWCNT)。碳纳米管重量轻、比表面积大，是研制药物递送载体的良好材料，因其展示的较高的稳定性和良好的生物相容性，在生物医学领域显示出了无限的应用前景［1，2］。有研究报道，碳纳米管对骨细胞的增殖分化及骨组织的生成具有明显的促进作用，能促进神经再生和减少神经组织瘢痕的产生［3，4］。随着对碳纳米管研究的深入，其生物安全性方面的报道也逐渐受到重视［5～8］。虽然碳纳米管对生物有一定的毒性作用，但其在生物医学应用领域仍被寄予厚望。目前生物学界对碳纳米管的免疫细胞效应仍知之甚少。本工作以来源于小鼠的RAW264．7巨噬细胞系作为吞噬细胞模型，采用荧光素标记的大肠杆菌E．coli k-12(FITC-E．coli k-12)作为吞噬体系，重点研究了MWCNT对巨噬细胞吞噬功能的影响。考虑到碳纳米管的可能毒性与剂量和作用时间的关系，笔者观察了不同浓度和不同作用时间的多壁碳纳米管的功效。

材料与方法

1．细胞和试剂:RAW264．7 巨噬细胞系、Hepes、DMEM(高糖)培养基、双抗(含青霉素和链霉素)及PBS缓冲液购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心;胎牛血清购自Gibco公司(USA);6孔板、12孔板等细胞培养耗材购自Corning公司(USA);荧光标记的大肠杆菌吞噬试剂盒(v6694 VybrantⓇPhagocytosis Assay Kit)购自Molecular Probes公司(USA)。

2．流式细胞术:常规培养RAW264．7细胞;选取对数生长期的RAW264．7细胞，用0．25%的胰酶消化成单个细胞，加入DMEM培养基终止消化，1000r/min离心5min，弃掉上清液，重新加入DMEM完全培养基充分重悬细胞。调整细胞浓度为5×105/ml，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种1ml，37℃培养。观察不同浓度MWCNT对RAW264．7吞噬能力的影响:实验设置5个浓度，MWCNT的浓度分别为0(对照组)、10、25、50 和 75μg/ml。另设流式细胞术的阴性对照组(即RAW264．7细胞吞噬无FITC标记的 DH-5α大肠杆菌)。MWCNT与RAW264．7细胞共同孵育12h。观察固定浓度(25μg/ml)MWCNT、不同作用时间对RAW264．7细胞吞噬能力的影响:实验设置5个时间点，分别为0(对照组)、4、7、9和24h。另设流式细胞术的阴性对照组。观察MWCNT对活化的RAW264．7细胞吞噬能力的影响:实验设置5个组，分别为对照组(不加MWCNT，也不加LPS)，LPS组(LPS 10μg/ml)，LPS+MWCNT 25μg/m 组，LPS+MWCNT 50μg/ml组，LPS+MWCNT 75μg/ml组，每组中的相应处理因素(LPS，MWCNT)均与RAW264．7细胞共孵育16h。另设流式细胞术的阴性对照组。观察RAW264．7细胞吞噬大肠杆菌:参照荧光素FITC标记大肠杆菌吞噬试剂盒的给定方法，解冻0．5ml HBSS缓冲液，并与FITC标记的大肠杆菌(E．coli k-12)干粉充分混匀，移入含4．5ml去离子水的棕色瓶中，超声混匀直至大肠杆菌微粒充分分散，于12孔板中每孔加入20μl微粒，阴性对照组加入不带荧光标记的DH-5α大肠杆菌。然后37℃避光孵育2h，吸弃上清，每孔加入200μl台盼蓝(pH 4．4)，反应 1min 以淬灭多余的E．coli k-12微粒。用PBS洗3次，收集细胞，加入500μl PBS充分重悬成单细胞悬液，用200目筛网过滤后，再用AccuriⓇC6流式细胞仪(美国BD公司生产)检测荧光强度。每个样本获取10000个细胞进行分析，已被吞噬的E．coli k-12的荧光强度检测，采用激发波长485nm，吸收波长530nm。计算吞噬指数，即RAW264．7细胞吞噬FITC-tagged E．coli k-12的平均数量，用平均荧光强度(MFI)表示:MFI=(FIsample-FInegative)/FInegative。公式中，FIsample表示样本的荧光强度，即RAW264．7吞噬FITC-E．coli k-12后的荧光强度;FInegative表示阴性对照组的荧光强度，即细胞吞噬DH-5α后的荧光强度。此外，笔者也关注了参与吞噬活动的RAW264．7细胞的百分比情况，用以反映整个RAW264．7细胞群体中参与吞噬活动的细胞比例。

3．统计学方法:用SPSS 22．0统计学软件进行分析，数据用均数±标准差(±s)表示。两组比较用分组检验，多组比较用方差分析进行统计学处理。以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．MWCNT剂量依赖性地抑制RAW264．7细胞的吞噬功能:流式细胞术结果如图1所示，对照组的RAW264．7细胞对FITC标记的大肠杆菌有一定的吞噬能力。随着 MWCNT浓度的递增(10、25、50和75μg/ml)，RAW264．7 细胞吞噬 FITC-tagged E．coli k-12的量(用平均荧光强度MFI表示)逐渐降低，与对照组相比分别降低了约 17．0%(P＜0．05)、46．6%、62．5%和70．4%(P ＜0．01)。参与吞噬活动的细胞百分比也从对照组的98．6%降低到 MWCNT 75μg/ml组的92．4%(P ＜0．05)。

图1 流式细胞术显示MWCNT浓度依赖性地抑制RAW264．7细胞对大肠杆菌的吞噬能力

2．MWCNT时间依赖性地抑制RAW264．7细胞吞噬大肠杆菌的能力:随着MWCNT孵育时间的延长(4、7、9、24h)，RAW264．7 细胞吞噬荧光标记大肠杆菌(FITC-E．coli k-12)的量(用平均荧光强度MFI表示)逐渐降低，与对照组相比分别降低了约28．4%、47．8%、63．2% 和 77．1%(P 均 ＜ 0．01)。参与吞噬活动的细胞百分比也逐渐降低，分别为对照组71．2%、MWCNT 4h 组 69．7%、MWCNT 7h 组65．1%、MWCNT 9h 组 52．0%、MWCNT 24h 组43．4%(P ＜0．05)，详见图2。

3．MWCNT对活化的RAW264．7细胞的吞噬功能的抑制作用:被LPS(10μg/ml)激活的RAW264．7细胞与静息RAW264．7细胞相比，吞噬FITC-tagged E．coli k-12的平均荧光强度(MFI)升高了约2．62倍(P＜0．01)。MWCNT能够抑制活化的RAW264．7细胞的吞噬能力，且随着MWCNT浓度的升高(25、50、75μg/ml)，活化的 RAW264．7 细胞吞噬大肠杆菌的量逐渐减少;参与吞噬的细胞百分比也逐渐降低，分别为:对照组64．2%，LPS组91．1%(与对照组相比，P ＜ 0．01)，LPS+MWCNT 25μg/ml组 85．4%，LPS+MWCNT 50μg/ml组 75．2%，LPS+MWCNT 75μg/ml组70．7%(3组分别与LPS单独作用相比，P均 ＜0．01)，详见图3。

图2 流式细胞术显示MWCNT时间依赖性地抑制RAW264．7细胞吞噬大肠杆菌的能力

图3 MWCNT抑制活化的RAW264．7细胞的吞噬功能

讨 论

随着碳纳米管在工程学、生物学和医学方面应用的迅速普及，人类和动物接触和摄入碳纳米管的概率也在增加，这势必增加了碳纳米管生物危害性的风险［9］。生物体对外源性入侵物质(如碳纳米管)的第一道防线是免疫系统，巨噬细胞吞噬异物是免除异物伤害的关键因素之一［10］。巨噬细胞与外源性异物的相互作用有两个方面，一方面是巨噬细胞吞噬和清除异物，另一方面是外源性异物(如碳纳米管)对巨噬细胞产生可能的伤害作用或其他效应，而对这种伤害作用或其他效应目前所知甚少。有研究发现，MWCNT聚集在小鼠肺部能够引起显著的促纤维化反应和炎症，而且能触发RAW264．7细胞产生H2O［11］2。每天6h将大鼠暴露在MWCNT气雾剂中，两周后支气管肺泡灌洗液中的中性粒细胞、肺泡巨噬细胞、白蛋白的量明显增多［12］。也有报道称，小鼠吸入MWCNT后，肺泡巨噬细胞内发现MWCNT颗粒，而且一定浓度的MWCNT能够减弱NK细胞的功能，导致免疫抑制，如T细胞依赖的抗体应答和T细胞的增殖能力降低［13］。由此可见，巨噬细胞在碳纳米管引起的机体免疫应答起到重要作用。但未见MWCNT对巨噬细胞吞噬功能影响的报道。

本工作重点研究了多壁碳纳米管对小鼠巨噬细胞系RAW264．7细胞的吞噬功能的影响。笔者观察了不同的MWCNT浓度和不同的MWCNT孵育时间对静息RAW264．7细胞吞噬功能的影响。研究发现，MWCNT能够进入RAW264．7细胞，这与之前的研究结果相一致［13］。同时笔者发现MWCNT能够显著减弱RAW264．7细胞吞噬FITC-E．coli k-12的能力，且呈现明显的浓度和时间依赖性。研究中笔者还比较了静息和LPS激活两种状态下，RAW264．7细胞吞噬功能的变化。结果显示，RAW264．7细胞在没有受到吞噬刺激因子LPS激活的状态下，也具有一定的吞噬能力。用LPS激活的RAW264．7细胞，其吞噬能力明显增强，这与预期和报道的结果一致［14］。MWCNT能够削弱LPS对吞噬的刺激作用，即MWCNT同样能够抑制激活的RAW264．7细胞的吞噬能力。

Pisanic等［15］在PC12神经细胞上发现 Fe2O3纳米材料对细胞骨架的破坏作用。Huang等［16］发现，长棒行单分散介孔碳纳米管使微丝断裂成无序状而在细胞膜附近皱缩破坏，从而破坏A375黑素瘤的细胞骨架。笔者认为MWCNT进入巨噬细胞后可能由于其三维结构的原因，对细胞骨架产生了一定的影响，进而阻碍了巨噬细胞吞噬其他物质。但MWCNT究竟如何影响吞噬，以及是否与细胞骨架有关，尚需进一步探索。

本项研究的主要技术手段是流式细胞术，其优势在于可以精确定量分析。研究结果提示，MWCNT对巨噬细胞吞噬功能有抑制作用。这一效应在今后的纳米生物学、纳米毒理学和纳米医学研究方面应引起重视。

1 Portney NG，Ozkan M．Nano-oncology:drug delivery，imaging，and sensing［J］．Anal Bioanal Chem，2006，384(3):620-630

2 Venkatesan N，Yoshimitsu J，Ito Y，et al．Liquid filled nanoparticles as a drug delivery tool for protein therapeutics［J］．Biomaterials，2005，26(34):7154-7163

3 Zanello LP，Zhao B，Hu H，et al．Bone cell proliferation on carbon nanotubes［J］．Nano Lett，2006，6(3):562-567

4 Mattson MP，Haddon RC，Rao AM．Molecular functionalization of carbon nanotubes and use as subs trates for neuronal growth［J］．J Mol Neurosci，2000，14(3):175-182

5 Tang S，Tang Y，Zhong L，et al．Short-and long-term toxicities of multi-walled carbon nanotubes in vivo and in vitro［J］．J Appl Toxicol，2012，32:900-912

6 Wako K，Kotani Y，Hirose A，et al．Effects of preparation methods for multi-wall carbon nanotube(MWCNT)suspensions on MWCNT induced rat pulmonary toxicity［J］．J Toxicological Sci，2010，35:437-446

7 Inoue K，Takano H，Koike E，et al．Effects of pulmonary exposure to carbon nanotubes on lung and systemic inflammation with coagulatory disturbance induced by lipopolysaccharide in mice［J］．Exp Biol Med，2008，233:1583-1590

8 Zhao Y，Xing G，Chai Z．Nanotoxicology:Are carbon nanotubes safe?［J］．Nat Nanotechnol，2008，3:191-192

9 Smith CJ，Shaw BJ，Handy RD．Toxicity of single walled carbon nanotubes to rainbow trout，(Oncorhynchus mykiss):respiratory toxicity，organ pathologies，and other physiological effects［J］．Aquat Toxicol，2007，82:94-109

10 Karin M，Lawrence T，Nizet V．Innate immunity gone awry:linking microbial infections to chronic inflammation and cancer［J］．Cell，2006，124(4):823-835

11 Van Berlo D，Wilhelmi V，Boots AW，et al．Apoptotic，inflammatory，and fibrogenic effects of two different types of multi-walled carbon nanotubes in mouse lung［J］．Arch Toxicol，2014，88(9):1725-1737

12 Umeda Y，Kasai T，Saito M，et al．Two-week toxicity of multi-walled carbon nanotubes by whole-body inhalation exposure in rats［J］．J Toxicol Pathol，2013，26(2):131-140

13 Mitchell LA，Gao J，Wal RV，et al．Pulmonary and systemic immune response to inhaled multiwalled carbon nanotubes［J］．Toxicol Sci，2007，100(1):203-214

14 Fang H，Pengal RA，Cao X，et al．Lipopolysaccharide-induced macrophage inflammatory response is regulated by SHIP［J］．J Immunol，2004，173(1):360-366

15 Pisanic II TR，Blackwell JD，Shubayev VI，et al．Nanotoxicity of iron oxide nanoparticle internalization in growing neurons［J］．Biomaterials，2007，28:2572-2581

16 Huang XL，Teng X，Chen D，et al．The effect of the shape of mesoporous silica nanoparticles on cellular uptake and cell function［J］．Biomaterials，2010，31:438-448