肉桂酰胺格尔德霉素增强肿瘤细胞对力达霉素敏感度的研究

李 良 韩菲菲 甄永苏

力达霉素(lidamycin，LDM)是利用精原细胞法从我国湖北省潜江县土壤中分离的链霉菌Streptomyces globisporus C-1027中筛选得到的一种烯二炔类抗生素，全部分子结构由1个110个氨基酸的酸性辅基蛋白(MW 10．5kDa)和1个含有九元环烯二炔结构的发色团(MW 843Da)通过非共价键结合而成［1，2］。LDM具有很强的细胞毒性，其主要机制是引起DNA分子断裂、损伤，LDM与细胞DNA分子结合后，经伯格曼环化反应生成双自由基中间体，所产生的自由基夺取核苷酸核糖骨架的氢原子进而引起细胞DNA断裂［3，4］。LDM对多种肿瘤细胞都具有明显的体内、体外抗肿瘤活性，其细胞水平的IC50值均为纳摩尔水平，因此是研制新型高效抗肿瘤药物的理想候选药物。

肉桂酰胺格尔德霉素［17-(6-cinnamamidohexylamino-)-17-demethoxygeldanamycin，CNDG］是本实验室在前期工作中合成的具有肉桂酰胺结构的格尔德霉素衍生物，其作用靶点是热休克蛋白90(heat shock protein，HSP90)。HSP90是一种有管家基因表达的的分子伴侣蛋白，主要功能维持细胞内蛋白质正确构象的形成［5］。HSP90在许多肿瘤中都存在过表达的现象，而且许多与肿瘤细胞分化、增生、侵袭密切相关的靶点分子均受HSP90调控，如BCRABL、EGFR、Her-2 等［6～9］。目前，正处于临床研究阶段的 HSP90抑制剂主要包括 17-AAG、17-DMAG、IPI-504 和 SNX2112 等［10，11］。近来有研究报道，HSP90抑制剂有增强化疗药物尤其是DNA损伤药物抗肿瘤活性的作用，这一作用可能与DNA损伤修复相关信号转导分子受HSP90调控有关［12］。本研究拟利用HSP90抑制剂CNDG与LDM联合应用，抑制LDM引起DNA断裂后所激活的DNA损伤修复信号转导途径，从而增强其抗肿瘤活性。

材料与方法

1．试剂与细胞株:力达霉素与肉桂酰胺格尔德霉素由本实验室制备。人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞Bel-7402、人肺癌细胞A549有实验室保存。MTT购自美国Sigma公司，ECL发光试剂盒购自美国Millipore公司，BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司，细胞培养基购自美国Invitrogen公司、所有抗体均为Cellsignal公司产品。

2．方法:(1)MTT法测定CNDG联合LDM对肿瘤细胞存活率的影响:取对数生长期细胞，以4000～5000/孔接种于96孔细胞培养板。24h后加入不同浓度的药物处理(LDM(0．05、0．1nmol/L)，CNDG(0．5、1、5μmol/L))，设至少 3 个平行孔。48h后向每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，37℃温育4h。吸出上清液，加入150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。用酶标仪在570nm处测定每个孔的吸光度(A)值。将各测试孔的A值减去本底A值，各平行孔的A值取平均数。细胞的存活率以T/C(%)表示，T为加药组细胞的A值，C为对照组细胞的A值。细胞存活率(%)=(T-本底A值)/(C-本底A值)×100%。两药联合指数(combination index，CI)=Vcomb/(VLDM×VCNDG)，Vcomb为联合给药组 T/C 比值，VLDM、VCNDG为单药组T/C比值。CI＜1表示有协同作用，CI=1表示有相加作用，CI＞1表示有拮抗作用。(2)CNDG联合LDM对肿瘤细胞周期的影响:接种细胞于6孔细胞培养板，CNDG联合LDM药物处理细胞，继续培养24h。收集细胞，1000r/min 4℃离心10min。重悬细胞，乙醇4℃固定。PI染色前，细胞用PBS洗两遍，然后重悬于PI染液中，37℃避光染色30min。细胞经过滤后用流式细胞仪测定DNA含量并分析细胞周期分布。(3)Western blot法检测CNDG联合LDM对肿瘤细胞ATRIP、c-PARP水平的影响:取药物处理后细胞株，根据不同实验要求在不同时间收集培养细胞。提取细胞总蛋白并用BCA试剂盒测定蛋白含量。SDS-PAGE电泳后取出凝胶，转PVDF膜。1%BSA封闭2h，加入1∶1000稀释的一抗，室温孵育2～3h，TBST洗膜3次;加入1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育2～3h，TBST洗膜6次。以ECL试剂盒检测蛋白条带，凝胶成像系统照相并保存分析结果。(4)免疫荧光检测CNDG联合LDM对肿瘤细胞γH2AX水平的影响:在不同时间用药物处理细胞，LDM和CNDG单独或联合处理;细胞经药物处理后用4%多聚甲醛固定30min，用PBS洗3次，0．1%NP-40 PBS-T打孔30min，1%BSA封闭1h，一抗孵育4℃过夜，用PBS洗3次，加入荧光标记的二抗37℃避光孵育1h，Hochest33258复染，50%甘油-PBS封片以防荧光淬灭，荧光显微镜下观察、拍照。

结 果

1．CNDG增强LDM对肿瘤细胞增生抑制作用:MTT法检测CNDG与LDM联合应用对人乳腺癌MCF-7、人肝癌Bel-7402、人肺癌A549细胞增生的影响，并计算联合指数。结果表明，CNDG 1、5μmol/L能明显增强LDM对肿瘤细胞增生抑制作用，CNDG与LDM 0．05nmol/L联合给药对3种肿瘤细胞的CI值＜1，显示协同作用(图1)。

2．CNDG改变LDM对肿瘤细胞周期的阻滞作用:LDM给药24h作用后对肿瘤细胞的G2/M期阻滞显著，MCF-7细胞从3．14%升高至47．76%，加入CNDG后G2/M期从47．76%下降到30．28%，G1期细胞增加。Bel-7402细胞从80．61%下降到60．43%。A549细胞从24．86%下降到8．29%(图2)。

3．CNDG与LDM联合影响肿瘤细胞DNA损伤修复相关信号转导分子蛋白水平:Western blot法检测与凋亡相关的PARP的切割水平，LDM与CNDG两药单药PARP的切割水平变化不明显，两种药物联合PARP切割水平显著提高。另外，LDM单药可增加MCF-7细胞ATRIP的水平，与CNDG联合应用使ATRIP蛋白水平显著下降(图3)。

4．CNDG与LDM联合对肿瘤细胞γH2AX的影响:γH2AX是细胞DNA损伤后可迅速聚集于细胞核DNA损伤部位的蛋白因子，其磷酸化水平反应细胞DNA损伤程度。γH2AX常用来表示DNA双链断裂程度。用免疫荧光的方法检测A549细胞经过CNDG和LDM处理后细胞内γH2AX水平以测定细胞内的DNA双链断裂水平，LDM给药1h后γH2AX阳性的细胞比例升高，经CNDG预处理的细胞γH2AX的荧光强度增强，表明DNA双链断裂水平增加(图4)。

讨 论

LDM属于九元环烯二炔类抗生素，具有高效细胞毒活性，其体内、体外抗肿瘤活性明显。这些作用均源于LDM与细胞DNA结合后自由基对DNA的断裂作用。肿瘤细胞经放疗、化疗等作用于DNA的治疗方式后可引起DNA损伤后修复，而这一过程可能会引起肿瘤细胞耐药。因此寻找靶向DNA损伤修复的药物是对抗肿瘤细胞耐药、增敏化疗药物的有效策略。DNA损伤后修复是细胞DNA受损后的自发反应，其中ATM/ATR信号转导途径发挥重要作用，ATM和ATR通过对下游信号分子的一系列磷酸化触发DNA修复［13］。作用于 DNA的药物通过 ATM、ATR等信号转导途径使肿瘤产生G2/M期阻滞，在此阻滞期细胞对受损DNA进行修复。这一机制对细胞的存活有重要的意义，低剂量DNA损伤药物或低剂量射线作用下，细胞可以通过这种修复的方式顺利的存活，当DNA损伤程度超出修复能力或修复机制受到干扰时会诱导肿瘤细胞死亡［14］。本研究选择了前期工作中得到的HSP90抑制剂CNDG作为LDM的增敏剂，实验结果显示LDM与HSP90抑制剂的联合给药大大增强了肿瘤杀伤作用，肿瘤细胞PARP的切割水平明显提高，达到了显著地协同作用。

图1 CNDG与LDM联合给药对MCF-7、Bel-7402、A549肿瘤细胞增生抑制作用

图2 CNDG联合LDM影响肿瘤细胞周期

图3 CNDG与LDM联合对肿瘤细胞DNA损伤修复相关c-PARP和ATRIP的影响

图4 用γH2AX分析A549细胞对DNA双链断裂的修复水平

在分子水平上，LDM单药组γH2AX的水平降低，双链断裂较少，而CNDG预处理组的γH2AX则显著增加，这一结果表明CNDG可以增强力达霉素对DNA的双链断裂作用。有研究报道，细胞接触LDM后即会同时激活ATM、ATR两条通路，与其他药物作用机制略有不同，LDM对两条通路可同时激活，且没有优先次序［15］。因此，只要二者之一激活的情况下即可诱导DNA的损伤后的细胞周期阻滞和DNA修复。单独抑制ATM或ATR通路并不能有效抑制肿瘤细胞的DNA修复。而CNDG可能通过抑制HSP90的活性进而抑制ATM/ATR两条通路以降低DNA的损伤后修复能力，增强肿瘤细胞对LDM的敏感度，因为ATM、ATR的活性均受 HSP90调控。ATRIP在DNA损伤后修复应答过程中同样具有重要作用，ATR发挥功能需要与ATRIP形成复合物。在本研究中，肿瘤细胞经CNDG处理后，ATRIP的水平显著下降，CNDG可以降低ATRIP的总蛋白水平，从而影响ATR通路的活性，降低了LDM作用后肿瘤细胞的DNA修复能力。

综上所述，本研究结果表明HSP90抑制剂CNDG能够明显增强肿瘤细胞对烯二炔类抗生素LDM的敏感度，作用机制可能与HSP90被抑制后DNA损伤修复相关信号转导因子蛋白水平及生物活性降低有关。同时针对DNA损伤修复机制研究新型抗肿瘤药物有可能是一种有效的抗肿瘤药物研究策略。

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