蛋白质组学在孤独症谱系障碍研究中的进展

欧阳建平 曾卓颖 洪文旭 段 山 曾序春

1.深圳市人口和计划生育科学研究所（518040）；2.深圳市疾病预防控制中心现代毒理学重点实验室

孤独症谱系障碍又名儿童孤独症或早年孤独样障碍，在我国香港、澳门、台湾等地及日本地区又常称为自闭症，是广泛性发育障碍（PDD）中最为常见的一种疾病。儿童孤独症谱系障碍一般发病在3岁前，以男性居多，男女比例为4～10：1。在西方发达国家，孤独症谱系障碍发病率同样呈现显著上升的趋势。在美国，1990年报道孤独症谱系障碍发病率为0.2%～0.7%；2007年的流行病学调查发现，全美3～17岁儿童青少年中，孤独症谱系障碍的患病率为1.1%［1］。38%的孤独症谱系障碍患儿不能独立生活，需要终生照顾，给家庭和社会造成了沉重负担。孤独症谱系障碍已经成为严重危害儿童青少年健康的常见精神疾病，同时给社会服务体系造成了极大负担。

语言交流障碍、社会交往障碍、兴趣行为异常是孤独症谱系障碍的临床三大主症。各国学者对孤独症谱系障碍病因研究极为关注，但迄今为止医学界没有找到这一严重发育缺陷的确切病因和特效治疗方法。我国1982年由陶国泰首先报道了4例儿童孤独症谱系障碍，开启了我国孤独症谱系障碍临床诊治和科学研究的大门。目前，已有实验室利用蛋白质组学开展孤独症谱系障碍的病因探讨，并取得一定的进展，本文对其作一综述，希望能对孤独症谱系障碍病因的研究和治愈孤独症谱系障碍药物的研发提供帮助。

1 孤独症谱系障碍的研究现状

孤独症谱系障碍的病因至今不明，国内外诸多学者从生理、解剖、免疫、神经生化和影像学等多方面对孤独症谱系障碍病因进行了广泛的探讨，并提出了一系列病因学假说。目前普遍认识到孤独症谱系障碍是一种在遗传因素作用下，受多种环境因子刺激导致的广泛性中枢神经系统发育障碍性疾病［2］。有关孤独症谱系障碍的双生子研究、家系研究、细胞遗传学及分子遗传学的研究均表明遗传因素在孤独症谱系障碍的病因中起着重要作用。孤独症谱系障碍的神经递质失衡学说认为，孤独症谱系障碍的发生是兴奋性神经递质和抑制性神经递质失调的结果，导致对大脑的过度刺激且大脑无力滤出环境和人体自身的过度刺激。还有其他研究结果显示脑器质性因素、神经生化因素、孕产期病变、感染及免疫异常等多方面原因均可能与孤独症谱系障碍有关［3］。

2 蛋白质组学

1994年Wilkins等人第一次提出蛋白质组概念，最初定义为"一个基因组所表达的蛋白"。蛋白质组学是从整体角度分析细胞内蛋白质组成的动态变化、表达水平和修饰状态，了解蛋白质间相互作用，揭示蛋白质功能与细胞活动的规律。通过蛋白质组学技术分析组织中蛋白表达和修饰的差异可以分离疾病分子标记物，该项技术已经广泛应用于各种疾病的研究和诊断，比如肝硬化、前列腺癌、膀胱癌、阿尔茨海默病等，特别在儿童发育紊乱疾病领域的研究较多，蛋白质组学技术在孤独症谱系障碍方面的研究也有非常大的潜力［4］。

3 蛋白质组学在孤独症谱系障碍研究中的进展

3.1 孤独症谱系障碍患者脑组织蛋白质组学研究

孤独症谱系障碍是中枢神经系统疾病，应用磁共振（MRI）对脑部的结构和功能进行研究，结果发现孤独症谱系障碍患者的脑干、小脑、大脑皮层等区域的细胞结构和形态表现异常。脑组织是孤独症谱系障碍最理想的研究材料，但用人脑做为实验材料存在以下一些问题：人脑比较稀缺，不易获得；人脑结构复杂，实验时很难取材均一；脑部细胞种类多，比较理想的方法是将各种脑细胞分离开，分别作蛋白质组学研究，但现在并没有理想的方法能将不同的脑细胞分离。通过蛋白质组学技术可能可以发现一些与脑发育相关蛋白。比如胆固醇与神经系统的发育相关，有文献报道胆固醇可能与孤独症谱系障碍相关［5］，在阿斯伯格症患者体内发现胆固醇总量比正常人高［6］，因此通过蛋白质组学技术可能能够发现与胆固醇代谢相关的蛋白在脑部的变化。通过对孤独症谱系障碍患者脑组织进行蛋白双向凝胶电泳分析发现，8个孤独症谱系障碍患者中有4个患者醛酮变位酶1（GLO1）在419号氨基酸位点发生突变（C419A），随后对71个孤独症谱系障碍患者和49个正常人的GLO1基因序列进行分析，发现该突变在孤独症谱系障碍患者中明显比正常人高［7］，证明该突变能显著降低GL01的活性。迄今为止使用人脑组织做孤独症谱系障碍蛋白质组学的研究极少。蛋白质组学技术已经广泛应用于老年痴呆症、帕金森等脑部精神疾病脑组织的研究，这些研究将为孤独症谱系障碍的脑部组织蛋白质组学研究提供有价值的参考。

3.2 孤独症谱系障碍患者脑脊液蛋白质组学研究

100年前就有人通过腰椎穿刺的方法获取脑脊液研究中枢神经系统疾病。脑脊液是最贴近中枢神经系统的细胞外液组织，它是研究中枢神经系统功能重要的实验材料。脑脊液是一种水样组织，清澈透明，含有少量细胞（0～4个/μl），蛋白浓度低，只有血液蛋白浓度的0.2%，其盐浓度与血液中相似［8］，但蛋白组分和血液有一定的差异，且其中各种蛋白质所占比例与血液中也有很大的差异。最初分离脑脊液蛋白的技术比较落后，只能分离出40种丰度较高的蛋白，随着双向凝胶电泳的应用，分离得到的脑脊液蛋白质种类大大增加［9］。双向电泳能从数百微升的脑脊液中分离数百种蛋白，因此很多实验室开始使用该技术研究各种精神疾病［10］。随着分离技术和质谱技术的进步，现在通过双向电泳技术和质谱技术鉴定的蛋白数量已经有了很大的提升。但这项技术有自身的缺陷，双向电泳重复性不佳，要在患者之间、患者和正常人之间比较双向电泳图谱较困难，且分离的蛋白分子量和等电点都有一定的范围要求。现在很多研究者更倾向于使用液相色谱和质谱联用（LC－MS）分离鉴定脑脊液中蛋白组分，液相色谱可以分离数百微克胰酶消化的蛋白混合物。目前已有多篇文献使用LC－MS分离鉴定脑脊液中蛋白组分。迄今为止使用脑脊液研究孤独症谱系障碍的报道极少，特别是蛋白质组学方面的研究更少，脑脊液对于孤独症谱系障碍的研究价值有待发掘。

3.3 孤独症谱系障碍患者血清蛋白质组学研究

脑组织和脑脊液获取较困难，脑组织不能通过活体获取，脑脊液虽然可以从活体中获取，但对患者具有一定的创伤，除了脑组织和脑脊液，现在更多的研究者将孤独症谱系障碍蛋白质组学研究聚焦在血清蛋白上。很多疾病能导致血清中部分蛋白在结构、功能和数量上发生变化，这种变化对疾病诊断监测和治疗具有重要的指导意义。孤独症谱系障碍可能会导致患者血液中蛋白、多肽、神经递质等的组分和活性发生变化。例如在孤独症谱系障碍患者血液中存在针对中枢神经系统抗原的自身抗体，血液中神经递质血清素和β-内啡肽含量增加，褪黑激素水平降低［11］，类鸦片活性肽水平增加，丝氨酸蛋白酶活性改变，补体系统非正常激活等。因此通过检测血液中蛋白和多肽等物质的异常变化，可能可以发现孤独症谱系障碍与这种变化之间的关系。Corbett等［12］使用高效液相色谱－电喷雾质谱法（LCESI－MS）对4～6岁的孤独症谱系障碍患者和正常人血液进行蛋白质组学分析，实验总共鉴定了6348个肽段，其中发现4种蛋白中的5个肽段在孤独症谱系障碍患者血液中高表达，这四种蛋白是apoB－100、补体因子FHR1、补体因子 C1q、FN1。apoB－100与磷脂、胆固醇、维他命E的运输相关，而胆固醇与神经系统的发育相关。补体因子FHR1、C1q表达异常表明孤独症谱系障碍患者体内补体系统可能活性异常。Momeni等［13］应用表面加强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI－TOF）技术分析孤独症谱系障碍患者血清蛋白组分发现，在孤独症谱系障碍患者血清中有3个肽段表达异常，且这3个肽段都是补体C3的肽段。Taurines等［14］采用疏水C8磁珠预分离血清蛋白，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MALDI－TOF－MS）分析预分离的血清蛋白，发现孤独症谱系障碍患者与正常人有3个MALDI－TOF－MS峰存在明显差异。血液中除了血浆蛋白可作为蛋白质组学研究材料外，血细胞也是蛋白质组学研究的重要材料，Shen等［15］从血液中分离单核细胞，经培养转化成淋巴细胞B，采用蛋白抗体芯片技术分析孤独症谱系障碍患者和正常人蛋白组分表达差异，结果发现4个与免疫通路相关的蛋白，即IKKα、Tyk2、EIF4G1、PRKCI表达异常。虽然现在还没有从血液中找到确切的孤独症谱系障碍生物标记物，但孤独症谱系障碍能导致血液中组分的改变，特别是免疫系统相关蛋白。虽然血液较容易获取，但血浆蛋白质组学研究中也有许多技术难题，如血浆中高丰度蛋白质的去除、血浆中蛋白质组分不稳定，加上实验室技术平台的不同造成不同实验室间数据可比性不强等问题均尚待解决。

4 展望

孤独症谱系障碍发病因素多，致病基因较多，且与环境等因素有密切关系，因此孤独症谱系障碍的诊断和治疗较困难。目前已经发现多种与孤独症谱系障碍相关基因，但这些基因远远不能解释孤独症谱系障碍的发病原因。蛋白质是生命活动的执行者，孤独症谱系障碍的临床表现可能是相关蛋白发生了改变，比如突变导致蛋白质、氨基酸序列改变，基因调控区突变导致蛋白表达量发生变化，或者蛋白质被异常修饰等。因此使用蛋白质组学技术可能可以发现这些变化。目前已经有实验室开展了孤独症谱系障碍在蛋白质组学方面的研究，并已经取得一定的进展。相信随着蛋白质组学在孤独症谱系障碍研究中的进一步深入，可以从中发现更多有价值的信息。

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