人乳头瘤病毒及其亚型在高原地区藏族妇女宫颈癌组织中的分布

才仁卓玛 扎洛 李兰英

青海红十字医院（西宁，810000）

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，占妇科恶性肿瘤之首，在发展中国家及发达国家的少数民族中发病率较高，可能与这些民族的文化差异、社会经济状态、卫生条件差异、缺乏健康知识等因素有一定的关系。人乳头瘤病毒（HPV）感染已被证明是宫颈癌的直接病因，HPV诱发宫颈癌通常要经历感染、感染长期持续、诱发癌前病变、进展为浸润癌的过程［1］。世界范围内的研究结果显示，不同 HPV亚型在不同地区和不同种族中存在差异，对不同种族人群致癌性的强弱也明显不同［2］。本研究旨在通过对高原地区181例藏族宫颈癌患者HPV型别分布进行分析，为高原地区宫颈癌防治、HPV疫苗的研发提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2010年3月～2013年9月在本院诊断为宫颈癌的藏族妇女宫颈脱落细胞标本作为研究标本，患者来自本省6个藏族自治州（即玉树、果洛、海南、海北、海西、黄南）及部分海东地区，共181例。均为农牧民，年龄26～70岁，平均年龄42岁。宫颈鳞癌177例，腺癌4例。

1.2 仪器与试剂

多聚酶链反应（PCR）仪（KP－CT48）、Hybri－Max医用核酸分子快速杂交仪、HPV DNA提取试剂盒和HPV核酸扩增分型检测试剂盒均购自凯普生物化学有限公司。对所有宫颈脱落细胞样本进行21种HPV亚型检测［4］，包括15种高危型 HPV（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68）和6种低危型 HPV（HPV 6、11、42、43、44、CP8304）。

1.3 试验方法

1.3.1 标本采集及保存 用棉拭子先除去宫颈口处多余的分泌物，用凯普专用宫颈刷伸入宫颈内2～3cm处转动3～5圈，取出宫颈刷放入含有细胞保存液的带盖样本管中，放置4℃冰箱中，在2周内检测。

1.3.2 样本DNA提取及PCR扩增 宫颈刷头充分漂洗，洗脱液，离心，弃上清液保留管底细胞，加入裂解液按试剂盒说明书提取DNA，抽提好的DNA样本作为模板进行PCR扩增。将PCR Mix、Tap酶和DNA模板按试剂盒说明书要求混匀，扩增反应体系为25μl，同时设阴性对照与阳性对照，常规PCR反应，退火温度55℃，扩增40个循环。

1.3.3 导流杂交 杂交仪及杂交液45℃预热后，在杂交平台上放入标记有21种HPV基因型寡核苷酸探针的低密度基因芯片，将PCR扩增产物加热变性冰浴后，加入检测孔内进行导流杂交；用封阻液封闭膜，排除封阻液后加入酶标液，25℃温育3.5min。用冲洗缓冲液彻底冲洗膜后加入NBT/BOIP底物显色3～5min。在显色后1h内分析结果。

1.3.4 结果判断 肉眼观察检测结果，阳性点呈现清晰的蓝紫色圆点，根据HPV分型分布图判断HPV亚型，如果出现≥1个HPV分型点则为单一或多重HPV感染，高危型HPV阳性或高危型和低危型HPV同时阳性者均视为高危型HPV感染，仅低危型HPV阳性者视为低危型HPV感染。生物素对照点（Biotin，反映酶与显色液反应）和内对照点（IC，质控模板DNA探针）出现阳性，表示结果正确。肉眼观察检测结果，阳性点为清晰可见的蓝紫色圆点，多个圆点阳性即为多重感染。每张芯片上有PCR反应质控点和杂交显色质控点各一个。

2 结果

2.1 HPV感染情况

181例藏族宫颈癌患者中HPV阳性170例，感染率为93.92%（170/181）。其中单一感染者156例，均为高危亚型感染，占宫颈癌患者的86.19%（156/181），占 HPV 阳性宫颈癌患者的 91.76%（156/170）；HPV多重感染者14例，占宫颈癌患者的7.73%（14/181），占 HPV 阳性宫颈癌患者的8.24%（14/170）。

2.2 HPV各亚型分布

181例宫颈癌样本中，检测出13种HPV亚型（12种高危亚型和1种低危亚型）。HPV各亚型出现的频率排序：16 型 71.18% （121/170）、58 型14.71% （25/170）、52 型 5.29% （9/170）、18 型4.71%（8/170）、53型4.12%（7/170）、39型2.35%（4/170）、45型1.76%（3/170）、66和68型1.18%（2/170）、33、35、59和6型0.59%（1/170）。

2.3 HPV多重感染各亚型分布

181例宫颈癌样本中，单一感染156例，占HPV阳性宫颈癌患者的91.76%（156/170），各亚型感染率由高到低依次为 HPV16、58、52、18、53。以HPV16单一感染为主共108例，占单一感染总数的63.23%（108/156），其次为 HPV58共21例，占单一感染总数的13.46%（21/156）。多重感染为14例，占宫颈癌患者的7.73%（14/181），占 HPV阳性宫颈癌患者的8.24%（14/170）。以二重感染为主，共13例（92.86%，13/14），均为 HPV16的合并感染，即 HPV 16＋58、16＋53、16＋39、16＋18、16＋45、16＋52、16＋66、16＋6，其中以 HPV16＋58最为常见（4/13），其次为 HPV 16＋53/16＋39各2例（，2/13）。三重感染1例（1/14），为 HPV 33＋59＋66，均为高危亚型，未见HPV16合并感染。

3 讨论

宫颈癌的发病具有经济、地理、人群及种族等分布特点，世界癌症组织的多中心研究提示［3－4］，不同国家不同地区HPV感染率不同，但是与宫颈癌的分布相一致。Das等［5］发现印度妇女宫颈癌中HPV－DNA检出率高达98%，我国海南地区宫颈癌患者中HPV感染率为94%［6］，本研究中宫颈癌患者HPV感染率为93.92%，与其他地区的报道基本一致。不同的地区流行的基因型有所不同，全球HPV感染率为10.4%、非洲22.1%、亚洲8.0%、欧洲 8.1%［7］。西 藏 地 区 9.19%［8］、青 海 地 区16.72%［9］、高 原 地 区 藏 族 19.50%［10］，北 京 地 区57.1%［11］。各地差异很大，总体上欠发达地区宫颈癌发病率高于较发达地区；地理位置而言，宫颈癌发病率农村比城市高、山区比平原高、内地比沿海高［12］；种族而言，世界范围内非洲裔美国人、拉丁美洲人、美洲印第安人的宫颈癌发病率较高［13］。

HPV在人群和宫颈癌患者中的分布呈现明显的地域特征，不同亚型HPV感染致癌性及其后果不同。世界范围内共同的最常见的亚型为HPV16和18，HPV16在所有HPV阳性的宫颈癌患者中的平均感染率为57.4%［14］。古扎丽努尔.阿不力孜等［15］报道的新疆维吾尔族宫颈癌 HPV16感染占94.31%，是目前发现HPV16感染率最高的地区。同样在不同的地区，除了HPV16，宫颈癌中 HPV其他型别的比例会有些差异，按照地区分类前5位分别为：非洲 HPV16、18、33、45、35；亚洲 HPV16、18、58、33、52；欧洲 HPV16、18、33、31、45［7］。2007年一项横跨我国7个宫颈癌发病率不同地区的19家医院开展的多中心研究结果显示［7］，在宫颈癌患者中最常发现的 HPV DNA类型是 HPV16、18、31、52、58。本地区藏族妇女HPV常见亚型依次为HPV16、58、52、53、18［10］，本研究中宫颈癌 HPV 常见亚型为 HPV16、58、52、18、53，分布相似，有民族和地域的分布特点。HPV16出现的频率最高，排在第2位的 HPV58占14.71%，其频率明显低于HPV16，与上述多个地区的研究结果不同。HPV52排在第3位，作为西方国家主要型别的HPV18相对少见，排在第4位，之后是HPV53，在青海地区和高原藏族妇女常见亚型中亦排名第4，HPV53可能是本地区和藏族相对其他地区和民族的优势型别。

HPV持续感染是宫颈癌及癌前病变的直接病因，而HPV多重感染是否促进宫颈病变的发生一直是学者们关注的问题。多数学者认为，多重感染并不增加宫颈癌的发生。大量研究提议持续感染同一种HPV高危型可能会加快个体的病变，但HPV高危型多重感染在宫颈病变的进展中是否起重要作用尚不明确［16］。文献报道 HPV的多重感染率从17.5%至58.9%不等［17］。在国际癌症研究组织（IARC）所进行的研究中，病例组多重感染为8.1%，对照组13.9%，对照组多重感染率较高，认为多重感染与宫颈病变的级别无关，多重感染并不增加宫颈癌的发生［18］。本研究结果也显示，藏族宫颈癌以单一高危型HPV感染为主，多重感染占7.73%。

青海高原地处青藏高原东北部，海拔大多在4000m以上。藏族人口集中在高寒、缺氧、经济、卫生条件落后、交通不便的6个藏族自治州，以游牧生活为主。单一的饮食结构、家庭式分娩，感染各种病原体的机会多、就诊机会少。患阴道炎、宫颈炎及宫颈糜烂不能及早得到诊治，从而增加了HPV感染的机会，使得藏族妇女患宫颈癌的几率也随之增加。宫颈癌是感染性疾病，预防HPV感染可以预防宫颈癌。发展农牧区经济，改善交通和居住条件，加大对基层的医疗投入，增强卫生保健知识的普及，提高妇女的卫生要求，加大对各种生殖道疾病的防治力度，同时对农牧区妇女进行定期的宫颈癌普查，以降低高原地区藏族妇女宫颈癌的发病率和死亡率。

［1］Schiffman M，Kjaer SK.Chapter 2：Natural History of Anogenital Human Papillomavirus Infection andNeoplasia［J］.J Natl Cancer Inst Monogr，2003，31：9－14.

［2］Shi JF，Qiao Yl，Smith JS，et al.Epidemiology and prevention of human papillomavirus and cervical cancer in China and Mongolia［J］.Vaecine，2008，26（Suppl 12）：53－59.

［3］Kin CJ，Jeong JK，Park M，et al.HPV oligonucleotide microarray－based detection of HPV genotypes in cervical neoplasticlestions［J］.Gynecol Oncol，2003，89（2）：210－217.

［4］Nagpal JK，Sahai S，Das BR.P53codon 72polymorphism and susceptibility to development of human papilloma virus 2associated cervical cancer in Indian women［J］.Eur J Clin lnvest，2002，32（12）：943－948.

［5］Das BC，Sharma JK，Gopalkrishna V，et al.A high frequency of human papillomavirus DNA sequences in cervical carcinomas of lndian women as revealed by Southern blot hybridization and polymerase chain reaction［J］.J Med Virol，1992，36：239－245.

［6］贺国丽，吴秀荣，杨舒盈，等.海南地区宫颈癌的HPV基因型检测及其临床意义［J］.实用妇产科杂志，2009，25（7）：407－409.

［7］赵方辉，乔友林.人乳头瘤病毒感染分子流行病学研究［J］.中国实用妇科与产科杂志，2010，26（5）：327－330.

［8］靳琼，沈铿，李辉，等.西藏自治区妇女子宫颈人乳头状瘤病毒感染现状调查及相关因素分析［J］.中华妇产科杂志，2009，44（12）：899.

［9］才仁卓玛，张建青，魏春梅.青海省26622名临床就诊妇女宫颈人乳头瘤病毒感染情况及亚型分布［J］.中国计划生育学杂志，2013，21（12）：812－816.

［10］才仁卓玛，张建青，魏春梅，等.高原地区藏族妇女宫颈人乳头瘤病毒感染各亚型分布状况调查［J］.中国计划生育学杂志，2014，22（6）：399－402.

［11］杨英捷，赵健，李雪倩，等.2 285例女性下生殖道人乳头瘤病毒感染筛查结果分析［J］.中国实用妇科与产科杂志，2006，22（6）：444－445.

［12］马丁，奚玲.宫颈癌流行病学研究进展［J］.实用妇产科杂志，2001，17（2）：61.

［13］Franco，Eduardo L，Duarte F，et al.Cervical cancer：epidemiology，prevention and the role of human papillomavirus infection［J］.Canadian Medical Association Journal，2001，l64（7）：1017－1025.

［14］Agnantis NJ，Sotiriadis A，Paraskevaidis E.111ecurrent status of HPV DNA testing［J］.European Journal of Gynaecological Oncology，2003，24（5）：351－356.

［15］古扎丽努尔·阿不力孜，程静新，米克热木，等.新疆维吾尔族妇女宫颈癌的 HPV谱研究［J］.肿瘤，2007，27（5）：379－382.

［16］An HJ，Cho NH，Lee SY，et al.Correlation of cervical carcinoma and precancerous lesions with human papilliomavirus（HPV）genotypes detected with the HPV DNA chip microarray method［J］.Cancer，2003，97（7）：1672－1680.

［17］Peyton CL，Gravitt PE，Hunt WC，et al.Determinants of genital human papillomavirus detection in a US population［J］.J Infect Dis，2001，183：1554－1564.

［18］Levi J E，Kleter B，Quint WG，et al.High prevalence of human papillomavirus（HPV）infections and high frepuency of multiple HPV genotypes in human immunodeficiency virusinfected women in Brazil［J］.J Clin Microbiol，2002，40（9）：3341－3345.