酱油酿造中蛋白酶系的研究进展

张金兰，王文平，王夫杰，张建，赵燕，*

（1.中国肉类食品综合研究中心，北京100068；2.北京食品科学研究院，北京100050；3.北京市食品酿造研究所，北京100050）

酱油酿造中蛋白酶系的研究进展

张金兰1，3，王文平2，王夫杰3，张建3，赵燕2，3*

（1.中国肉类食品综合研究中心，北京100068；2.北京食品科学研究院，北京100050；3.北京市食品酿造研究所，北京100050）

蛋白酶是酱油酿造中最重要的酶，对酱油产品品质和生产成本起着决定性的作用。文中分别从酱油酿造中蛋白酶的分类特性、高蛋白酶活力菌株的选育、影响蛋白酶活的因素几个方面对研究报道进行了综述。对酱油酿造中纯化出的蛋白酶、菌株选育的方法、酿造各阶段影响蛋白酶活的因素进行了详细的介绍，并对酱油酿造中蛋白酶系的研究前景进行了预测。

酱油；蛋白酶系；蛋白酶活力

酱油酿造中的微生物以曲霉为主，兼有酵母菌和细菌。蛋白酶作为曲霉所产的主要胞外酶之一，在酱油的酿造过程中具有极为重要的作用，它参与原料的降解过程，提高蛋白酶活，可以提高原料利用率，降低企业成本；且其降解产物多肽和氨基酸等都会对酱醪发酵阶段的酵母菌及乳酸菌发酵产生影响，进而影响到酱油的风味。本文对酱油酿造中的蛋白酶系研究现状进行综述，以期为酱油原料利用率的提高和生产技术的进步提供借鉴。

酱油生产过程中蛋白质的分解过程是蛋白质内切酶将原料中的蛋白质降解为肽，起着蛋白质溶解，促进原料的利用和着色的作用，这是酱油原料分解的第一步。酱油原料分解的第二步是原料接着在蛋白质外切酶（即肽酶）的作用下，将小分子的肽进一步水解为氨基酸，对酱油的风味和颜色起着重要的作用；肽酶可分为亮氨酸氨基肽酶等氨基肽酶、酸性羧基肽酶。最后谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的作用下，分解为谷氨酸，对酱油的风味起着决定性的作用。

目前对酱油蛋白酶系的研究集中在蛋白酶的分离纯化、诱变菌株提高酶活力等；近年来也有学者研究其蛋白酶组分、分析组分之间的酶学性质差异、影响酶活的因素等。这些研究对酱油生产技术的进步，具有重要的理论指导意义。

1 酱油生产中的蛋白质内切酶的分类及特性

酱油生产中的蛋白质内切酶目前分离纯化出来的可以分为碱性蛋白酶（微生物丝氨酸蛋白酶）、中性蛋白酶（微生物金属蛋白酶）、酸性蛋白酶（微生物天冬氨酸酶）、半碱性蛋白酶。

在酱油曲抽出液中，碱性蛋白酶的活性是极强的，对这种酶的研究也最深入。许多碱性蛋白酶已经从米曲霉、酱油曲霉等分离出来，然而这些酶在大豆蛋白的水解中真正起的作用并不明确，直到用纯化的多种酶对发酵系统进行了模拟分析[1]。NAKADAI T等[2]从米曲霉460中纯化出了一种碱性蛋白酶，其分子质量约为23 000 u，该碱性蛋白酶没有羧基肽酶和氨基肽酶活力，但是能水解异亮氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺-半胱氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-氨基（Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2）中的亮氨酸-甘氨酸（Leu-Gly）肽键；聚左旋α-谷氨酸（poly-L-α-glutamic acid）；聚左旋赖氨酸（poly-L-lysine）；苄氧羰基-亮氨酸-甘氨酸-氨基（Cbz-Leu-Gly-NH2）中的甘氨酸-氨基（Gly-NH2）键；苄氧羰基-脯氨酸-亮氨酸-氨基（Cbz-Pro-Leu-NH2）中的亮氨酸-氨基（Leu-NH2）键。大月秀夫等[3]从米曲霉的麸曲抽出液中分离出最适pH值为8.2～8.4的半碱性蛋白酶结晶，其相对分子质量大约为32000u，该酶尚未在米曲霉的液体培养液及其他曲霉的麸曲培养液中发现。

目前，许多研究者从曲霉中分离出了中性蛋白酶，虽然酱油曲霉中分离出的蛋白酶已经纯化为均一物质，但是该酶作用于人工合成肽的机理还没有研究。NAKADAI T等[4-5]从米曲霉中分离出两种中性蛋白酶，最近的研究认为中性蛋白酶仅仅将大豆蛋白水解为寡肽和少部分的游离氨基酸，纯化的中性蛋白酶Ⅰ没有氨基端肽酶和羧基端肽酶活性，可以水解苄氧羰基-甘氨酸-苯丙氨酸-氨基（Cbz-Gly-Phe-NH2）的甘氨酸-苯丙氨酸（Gly-Phe）键，苄氧羰基-甘氨酸-亮氨酸-氨基（Cbz-Gly-Leu-NH2）的甘氨酸-亮氨酸（Gly-Leu）键，苄氧羰基-脯氨酸-亮氨酸-氨基（Cbz-Pro-Leu-NH2）的脯氨酸-亮氨酸（Pro-Leu）键，聚左旋α-谷氨酸（poly-L-α-glutamic acid）；聚左旋赖氨酸（poly-L-lysine）。该酶活性被乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抑制，但不被氟磷酸二异丙酯（diisopropyl fluorophosphates，DFP）抑制。中性蛋白酶Ⅱ对二肽、三肽和苄氧羰基-甘氨酸-苯丙氨酸-氨基（Cbz-Gly-Phe-NH2）没有活力，对多聚赖氨酸和多聚谷氨酸有微弱的活力，其最适pH为5.5～6.0，在90℃加热10 min后仍保持有70%的活力，在EDTA（10-2mol/L）下损失70%的活力，在18%的氯化钠溶液中仍能保持50%的活力。

米曲霉分泌的酸性蛋白酶纯化后在pH值为3.5条件下可以激活牛胰蛋白酶原和糜蛋白酶原，而且对前者的切割位点在牛胰凝乳蛋白酶原的精氨酸（15）-异亮氨酸（16）（Arg（15）-Ile（16））处，它也能水解合成的胃蛋白酶底物苄氧羰基-组氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸乙酯（Cbz-His-Phe-Phe-Oet）和苄氧羰基-丙氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-哌嗪丙酯（Cbz-Ala-Ala-Phe-Phe-4-OPy-Pr），切割位点均在苯丙氨酸-苯丙氨酸（Phe-Phe）处[6-7]。米曲霉460分离出的酸性蛋白酶对酪蛋白的最适pH值为3.7，分子质量经凝胶层析过滤测定，约39 000 u。酸性蛋白酶没有酸性羧基肽酶的活力，也没有氨基肽酶的活力，是一种典型的内肽酶，水解蛋白质仅释放少量的游离氨基酸。酸性蛋白酶和酸性羧基肽酶混合作用，可水解蛋白质释放大量游离氨基酸[8]。

2 酱油成曲中蛋白质外切酶的分类及特性

肽酶可分为氨基肽酶和羧基肽酶；氨基肽酶是在氨基端水解蛋白质和多肽的肽键，羧基肽酶是在羧基端水解蛋白质和肽的肽键；微生物的肽酶在分解外源蛋白质获得必需氨基酸、提供代谢的能量和辅助因子的循环方面有重要的意义[9]。

NAKADAI T等[10]在对大豆蛋白质分解中，对于生成全氮、甲醛滴定氮、谷氨酸有关的这些酶之作用，以正交试验法进行了统计学的分析，结果查明在酱油酿造中，中性蛋白酶对甲醛滴定氮、谷氨酸的生成无关。而肽酶特别是亮氨酸氨基肽酶I所起的作用最大。再者，研究了这些酶的性质，特别是对合成肽的作用，结果查明肽酶对许多的低分子肽都显示出分解活性。在使用不同微生物来源的酶分解大豆蛋白质时，酿造用米曲霉来源的肽酶，无论从量上或从质上来说，都较其他微生物的酶优越。目前，对酱油生产中的肽酶的报道以亮氨酸氨基肽酶和羧基肽酶居多。

NAKADAI T[1]报道了米曲霉460所产亮氨酸氨基肽酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的纯化及特性研究。以L-亮氨酸-β-萘基胺为底物，纯化出的米曲霉460亮氨酸氨基肽酶Ⅰ最适pH值为8.5，酶的分子质量约为26 500 u，因其能够专一性的水解以亮氨酸为氨基酸末端的寡肽而命名，该酶可以被金属螯合剂和二硫键分离剂所抑制，但不被巯基试剂抑制[10]。以L-亮氨酸-β-萘基胺和左旋亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸（L-Leu-Gly-Gly）为底物，亮氨酸氨基肽酶Ⅱ最适pH值为8.0，酶的分子质量约为61 000 u，该酶可以被金属螯合剂和二硫键分离剂所抑制，但不被巯基试剂抑制，该酶对亮氨酸为氨基末端的寡肽具有很强的活性，证明这是一种亮氨酸氨基肽酶[11]；亮氨酸氨基肽酶Ⅲ经过溶剂沉淀、阴离子-纤维素柱层析、阴离子-葡聚糖A50柱层析、磺基纤维素柱层析、凝胶过滤层析而得到纯化，纯化后的酶达到了电泳纯。以左旋亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸（L-Leu-Gly-Gly）为底物，该酶的最适pH值为8.0，活性可以被巯基试剂抑制，分子质量大约为56 000 u[12]；CHIEN H C R等[13]纯化的酱油曲霉（ATCC 42249）的亮氨酸氨基肽酶，最适pH值为9.0，最适反应温度为70℃。

NAKADAI T[14-17]报道了米曲霉460所产羧基肽酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的纯化及特性研究，以苄氧羰基-丙氨酸-谷氨酸（Cbz-Ala-Glu）为底物，纯化的酸性羧基肽酶Ⅰ最适pH值为4.0，该酶可以被巯基试剂抑制，但是不被金属螯合剂抑制，其分子质量约为26 500 u，经过有机溶剂分离、阴离子交换层析、二乙氨乙基-交联葡聚糖凝胶层析、阳离子交换层析而得到纯化[14]。以苄氧羰基-谷氨酸-酪氨酸（Cbz-Glu-Tyr）为底物，纯化的酸性羧基肽酶Ⅱ最适pH值为3.0，该酶可以被异丙硫醚和巯基试剂（如对氯汞苯甲酸盐和碘乙酸盐）抑制，但不被金属螯合剂抑制，其分子质量约为105 000 u[15]。以苄氧羰基-谷氨酸-酪氨酸（Cbz-Glu-Tyr）为底物，纯化的酸性羧基肽酶Ⅲ最适pH值为3.0，该酶可以被异丙硫醚和巯基试剂（如对氯汞苯甲酸盐和碘乙酸盐）抑制，但不被金属螯合剂抑制，其分子质量约为61 000 u，可以还水解聚α-L-谷氨酸[16]。以苄氧羰基-谷氨酸-酪氨酸（Cbz-Glu-Tyr）为底物，纯化的酸性羧基肽酶Ⅳ最适pH值为3.0，该酶可以被异丙硫醚和巯基试剂抑制，但不被金属螯合剂抑制，其分子质量约为43 000 u，经过有机溶剂分离、阴离子交换层析、二乙氨乙基-交联葡聚糖凝胶层析、疏水作用层析、阳离子交换层析和凝胶过滤层析制得[17]。

3 谷氨酰胺酶

谷氨酰胺酶催化L-型谷氨酰胺水解为L-型谷氨酸，谷氨酸是食品中重要的风味物质。在酱油的发酵过程中，L-型谷氨酸的产生途径有两种：一是蛋白酶或肽酶直接水解原料蛋白质获得；二是谷氨酰胺酶水解原料蛋白质中游离出来的谷氨酰胺，其是酱油发酵过程中促进风味形成的重要步骤。由于L-型谷氨酸可以转化为没有风味贡献的焦谷氨酸，这不需要酶的参与，并且以非常快的速度进行[18]。在酱油中的谷氨酸的浓度取决于用于发酵的米曲霉的谷氨酰胺酶的活性[19]和米曲霉细胞壁上的谷氨酰胺酶的活力[20]，因此，在酱油酿造过程中，L-型谷氨酸被认为是谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的作用下转化而来的[21]。在酱油发酵过程中，由于谷氨酰胺酶是增加谷氨酸浓度的关键酶，对于开发出谷氨酰胺酶活力高的成曲极为重要。

米曲霉产的许多谷氨酰胺酶已经被分离鉴定[22]。MASUO N等[23]最近发现在米曲霉RIB40的基因组中有四种谷氨酰胺酶的基因（米曲霉谷氨酰胺酶基因A，米曲霉谷氨酰胺酶基因B，米曲霉谷氨酰胺酶基因C，米曲霉谷氨酰胺酶基因D可以被重新分类，这是由于其和隐球酵母（Cryptococcus nodaensis）[24]产生的耐盐耐热的谷氨酰胺酶一致。表达序列标签（expressed sequence tag，EST）分析表明，隐球酵母谷氨酰胺酶基因在固态培养的条件下表达。酱油曲霉谷氨酰胺酶基因A源自酱油曲霉，研究人员克隆了它的同源基因，并从过量表达的菌株中纯化出谷氨酰胺酶A的基因，并研究了酶的特性，这使谷氨酰胺酶被分类到谷氨酰胺-天冬氨酸酶类型[25]。因此，许多米曲霉和酱油曲霉中得基因都编码蛋白质，具有谷氨酰胺酶活性，但这些基因是否对酱油发酵过程中谷氨酸的形成有贡献并不清楚。

曲霉的谷氨酰胺酶活性在混合培养基中显然高于单一培养基。UEKI T等[26]试验了9种米曲霉在单一培养基中的谷氨酰胺酶活性。当使用混合接种物的以1∶1接种时，谷氨酰胺酶的活力通常是翻了一倍。为了制得混合的酱油曲，特殊的微生物不需要被纯化。在酱油生产过程中使用混合酱油曲，不仅能改善制曲过程中的生产环境，还能增加酱油中的谷氨酸含量。

4 高蛋白酶活菌株的选育

菌种蛋白酶活力低会造成成曲质量不良、发酵周期长、原料利用率低等问题，严重影响企业经济效益和产品品质的提高，因此大量科研人员对酱油生产中高产蛋白酶的菌株进行了诱变筛选。

黄伟等[27]从保靖酱醅中分离得到一株米曲霉，采用紫外线筛选出的突变株比原菌株蛋白酶活提高了1.47倍；刘达玉等[28]将从酱油厂曲池中分离纯化的5株米曲霉作为出发菌株，经紫外诱变后，通过初筛、复筛和遗传稳定性试验，筛选获得1株具有蛋白酶活力且遗传稳定的变异菌株。该菌株蛋白酶活力1 245.17 U/g，是同培养条件下的沪酿3.042酶活力的1.21倍。王华等[29]研究了高压对米曲霉的诱变，研究发现，在一定压力范围内（0.1～200 MPa）蛋白酶的活性随着压力的增加而减小，但随着压力的进一步升高（200～400MPa）蛋白酶的活性又逐渐增强，在300 MPa时超过对照组，400 MPa时蛋白酶的活性达到最高值，这就为菌种的进一步筛选创造了有利条件。NOBUYOSHI I等[30]对生产菌种曾进行过X射线照射诱变，得到蛋白酶活力比原出发菌株高2倍的x816菌株，SEIICHI N等[31]再次诱变，把x816的蛋白酶活提高到6倍，所得到的变异株与原出发菌株的酶系统没有改变。

邓靖等[32]采用紫外线、硫酸二乙酯以及复合诱变，结果表明，经紫外线诱变后，米曲霉碱性蛋白酶活力增强较明显；经硫酸二乙酯诱变后，米曲霉中性蛋白酶、酸性蛋白酶活力增强较明显；经硫酸二乙酯-紫外线诱变后，米曲霉中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶活力都明显增强。有学者以米曲霉l-7.3为出发菌株，通过紫外诱变，采用含有不同制霉素药物浓度的马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基，初筛得到生长速度快、孢子颜色和菌落形态发生变化的菌株125株[33]。通过制曲复筛进一步得到了一株综合酶系优良的目标菌株80110，该菌株产生的酸性蛋白酶和中性蛋白酶的酶活力较之1-7.3分别提高了230.10%和17.50%。林剑青等[34]对米曲霉与酱油曲霉进行诱变选育，实验通过紫外诱变、亚硝基胍诱变以及紫外-亚硝基胍复合诱变方法分别对米曲霉和酱油曲霉菌株进行了诱变，采用酪蛋白透明法初筛以及福林酚法结合3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法复筛，根据碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活水平的变化，选育出2株米曲霉高酶活菌株，3株酱油曲霉高酶活菌株。傅力等[35]通过对沪酿3.042米曲霉的原生质体进行紫外线-氯化锂复合诱变，筛选出蛋白酶活力高的菌株UF366，其蛋白酶活力达1 440 U/g，比对照提高了33.3%。UF366菌株的遗传稳定性好，在pH值为7.2，40℃时其中性蛋白酶活力最高。

5 影响蛋白酶活的因素

张贺迎等[36]认为大量孢子不利于蛋白酶活力的提高，研发的一种激活剂可以促进米曲霉生长，诱导、激活米曲霉分泌各种酶，并抑制孢子生成，提高成曲蛋白酶活力。何青等[37]对19个米曲霉菌株的蛋白酶活力与孢子颜色加以比较，认为孢子颜色为绿色菌株蛋白酶活力高，平均值为10908U/g干曲，孢子颜色为黄色菌株，蛋白酶活力较低，平均值为1 663 U/g干曲，绿色菌株蛋白酶活力是黄色菌株蛋白酶活力的7倍左右。

沙慧琴等[38]研究了添加微量元素、激活剂、植酸对米曲霉产蛋白酶活力的影响，结果表明，当采用固体培养基时，加入微量元素对米曲霉产蛋白酶产生了抑制作用；试验中3号激活剂质量分数为0.5%、1.0%时，对米曲霉产生蛋白酶的促进作用最为明显；当植酸的加入量为0.18%时，对米曲霉产生蛋白酶的作用效果较好。为今后的生产实践提供了参考价值。张贺迎等[39]研究了不同外源酶添加量对酱油成曲酶活的影响，制曲过程中，米曲霉所产生的酶很难彻底分解原料，添加外源酶能有效地弥补其自身酶系种类与数量的不足，提高原料利用率，但应考虑外源酶分解和阻遏两种作用，加入原料质量0.008%的蛋白酶效果最好，使成曲酶活提高了22%。

从实际情况来说，最好的酱醪为冬天制得，而夏天制得的酱醪有较少的游离态氨基酸和谷氨酸，这说明温度对酱油生产中的蛋白酶系有较大的影响。SU N W等[40]发现酱油曲中粗酶的蛋白酶活力在45℃作用240 min，活力仅存70%，在55℃处理240 min，活力仅存17%。NAKAHARA T等[41]研究发现，亮氨酸氨基肽酶I和亮氨酸氨基肽酶II的活性在45℃很快下降至44%和12%，相反的，在15℃将成曲孵育6 d，亮氨酸氨基肽酶I的活力有所升高，这可能是由于细胞内的氨基肽酶不断的释放出来。酸性羧基肽酶在45℃、15℃和30℃孵育6 d，其活力并不受到影响，这说明酸性羧基肽酶对温度有良好的稳定性。YOKOTSUKA T等[42]发现较低的温度可以阻止pH的快速降低并且钝化碱性蛋白酶，更重要的是，谷氨酰胺酶对温度也极为敏感。

陈伯林[43]研究了乙醇对酱油发酵体系中蛋白酶系的影响，发现乙醇对碱性蛋白酶的稳定性影响很大，特别是在发酵温度为30℃、pH 5.0、乙醇含量＞2%时碱性蛋白酶失活加剧；乙醇对中性蛋白酶活力的抑制作用较明显，特别是在乙醇含量＞2%以后，其活力急剧下降，最低降到38%。研究结果显示，适度的酒精发酵对氨基酸态氮生成和原料蛋白利用率有益，但过度的酒精发酵则会起到相反的作用。

氯化钠质量分数过高较明显的抑制了蛋白酶的活力。根据SU N W等[39]的研究结果在18%的氯化钠质量分数条件下（酱汁中盐含量的一般值），仅3%的蛋白酶活力残存。酱油曲中活性蛋白酶可能被盐析出或者由于高盐而变性，5%的氯化钠降低蛋白酶的活力62%。根据研究结果，建议酱油曲采用45℃，＜5%的氯化钠质量分数，短时间对酱油进行快速发酵预处理。

6 展望

在我国现有市场竞争机制下，酱油生产企业大多只注重短期的生产成本，无暇顾及酱油生产过程中的基础研究，因此导致近年来我国酱油生产技术的发展与日本等国家的差距越来越大。

酱油中主要的风味物质为从原料蛋白质降解得到的氨基酸和短链肽。由于这个原因，酱油曲的蛋白酶活力在酱油的整个生产中显得尤为重要。酿造过程中蛋白质的降解是在蛋白酶系的作用下完成的，因此提高蛋白酶的活力就可以提高原料的蛋白利用率并缩短酿造周期，通过研究酱油蛋白酶系，可以使酱醅中各种酶类的比例更趋合理，从而提高氨基酸生成率和原料利用率。

优化酱油生产中的蛋白酶系，可提高酱油的出品率，提升酱油产品的风味，有利于酱油产业的可持续发展，也为改进酱油传统生产工艺、促进现代生物技术在酱油生产中的进一步应用提供理论技术依据。

[1]NAKADAI T.Role of each enzyme produced by soy sauce-koji[J].J Jpn Soy Sauce Res Inst,1985,11(2):67-79.

[2]NAKADAI T,SEIICHI N,NOBUYOSHI I.Purification and properties of alkaline proteinase fromAspergillus Oryzae[J].Agric Biol Chem,1973, 37(12):2685-2694.

[3]大月秀夫，兼松善範，本川保之.麹菌の生産する諸酵素とそれらの諸味中での作用機作[J].日本醤油研究所雑誌，1982，8（6）：242-247.

[4]NAKADAI T,SEIICHI N,NOBUYOSHI I.Purification and properties of neutral proteinase I fromAspergillus oryzae[J].Agric Biol Chem,1973, 37(12):2695-2701.

[5]NAKADAI T,SEIICHI N,NOBUYOSHI I.Purification and properties of neutral proteinase II fromAspergillus oryzae[J].Agric Biol Chem,1973, 37(12):2703-2708.

[6]RAPHAEL D,ARIEH G,THEO H.Aspergillus oryzaeacid proteinase: purification and properties,and formation fo 7r-chymotrypsin[J].J Biochem,1975,147(1):45-53.

[7]KAMITORI S,OHTAKI A,INO H.Crystal structures ofAspergillus oryzaeaspartic proteinase and its complex with an inhibitor pepstatin at 1.9A resolution[J].J Mol Biol,2003,326(5):1503-1511.

[8]NAKADAI T,SEIICHI N.The Action of acid proteinase fromAspergillus oryzaeon soybean proteins[J].Agric Biol Chem,1977,41(2): 409-410.

[9]POLAINA J,MACCABE A P.Industrial enzymes[M].Berlin:Springer, 2007.

[10]NAKADAI T,SEIICHI N,NOBUYOSHI I.Purification and properties of leucine aminopeptidase I fromAspergillus oryzae[J].Agric Biol Chem,1973,37(4):757-765.

[11]NAKADAI T,SEIICHI N,NOBUYOSHI I.Purification and properties of leucine aminopeptidase II fromAspergillus oryzae[J].Agric Biol Chem,1973,37(4):767-774.

[12]NAKADAI T,SEIICHI N,NOBUYOSHI I.Purification and properties of leucine aminopeptidase III fromAspergillus oryzae[J].Agric Biol Chem,1973,37(4):775-782.

[13]CHIEN H C R,LIN L L,CHAO S H,et al.Purification,characterization,and genetic analysis of a leucine aminopeptidase fromAspergillussojae[J].Biochim Biophys Acta,2002,1576(1-2):119-126.

[14]NAKADAI T,SEIICHI N,NOBUYOSHI I.Purification and properties of acid carboxypeptidase I fromAspergillus oryzae[J].Agric Biol Chem,1972,36(8):1343-1352.

[15]NAKADAI T,SEIICHI N,NOBUYOSHI I.Purification and properties of acid carboxypeptidaseⅡfromAspergillus oryzae[J].Agric Biol Chem,1972,36(9):1473-1480.

[16]NAKADAI T,SEIICHI N,NOBUYOSHI I.Purification and properties of acid carboxypeptidaseⅢfromAspergillus oryzae[J].Agric Biol Chem,1972,36(9):1481-1488.

[17]NAKADAI T,SEIICHI N,NOBUYOSHI I.Purification and properties of acid carboxypeptidaseⅣfromAspergillus oryzae[J].Agric Biol Chem,1973,36(6):1237-1251.

[18]YAMAMOTO S,HIROOKA H.Production of glutaminase byAspergillus sojae[J].J Ferment Technol,1974,52(8):564-569.

[19]YANO T,ITO M,TOMITA K,et al.Purification and properties of glutaminase fromAspergillus oryzae[J].J Ferment Technol,1988,66: 137-143.

[20]SHIKATA H,YASUI T,ISHIGAMI Y,et al.Studies on the glutaminase of shoyu koji(part 2)[J].J Jpn Soy Sauce Res Inst,1979,5:21-25.

[21]YASUI T,SHIKATA H,ISHIGAMI Y,et al.Studies on the glutaminase of shoyu koji(Part 3)[J].J Jpn Soy Sauce Res Inst,1982,8:117-122.

[22]KOIBUCHI K,NAGASAKI H,YUASA A,et al.Molecular cloning and characterization of a gene encoding glutaminase fromAspergillus oryzae [J].Appl Microbiol Biotechnol,2000,54(1):59-68.

[23]MASUO N,ITO K,YOSHIMUNE K,et al.Molecular cloning,overexpression,and purification ofMicrococcus luteusK-3-type glutaminase fromAspergillus oryzaeRIB40[J].Protein Expr Purif,2004,38(2): 272-278.

[24]MASUO N,YOSHIMUNE K,ITO K,et al.Micrococcus luteus K-3-type glutaminase fromAspergillus oryzaeRIB40 is salt-tolerant[J].J Biosci Bioeng,2005,100(5):576-578.

[25]ITO K,KOYAMA Y.Analysis of specific proteolytic digestion of the peptidoglutaminase-asparaginase of koji mold[J].J Biosci Bioeng, 2014,118(3):253-255.

[26]UEKI T,NODA Y,TERAMOTO Y,et al.Increasing glutaminase activity in shoyu koji using a mixed culture of two koji moulds[J].World J Microb Biot,1994,10(6):694-696.

[27]黄伟，麻成金，黄群，等.保靖酱油高产蛋白酶米曲霉菌种选育及产酶条件研究[J].食品与发酵科技，2009，45（4）：32-35.

[28]刘达玉，段献银，黄丹，等.高盐稀态酱油专用米曲霉的紫外诱变选育[J].西南大学学报：自然科学版，2013（2）：155-159.

[29]王华，申斯乐，李志慧，等.高压对米曲霉理化性质影响及诱变的研究[J].高压物理学报，2008（3）：259-264.

[30]NOBUYOSHI I,KISHIRO Y.Studies onAspergilli:Part 11.The comparison of the proteolytic enzyme system between the induced mutant x-816 and the parent strain(1)[J].Nippon Nōgeikagaku Kaishi,1955, 29(6):387-393.

[31]SEIICHI N,TADAHIKO O,NOBUYOSHI I.Successive isolation of proteinase hyperproductive mutants ofAspergillus sojae[J].Agric Biol Chem,1971,35(2):291-293.

[32]马俊阳.一株米曲霉所产蛋白酶酶解特性及其在调味品中的应用研究[D].无锡：江南大学硕士论文，2003.

[33]邓静，吴华昌.不同诱变方法对米曲霉酶系的影响[J].中国酿造，2005，24（12）：39-42.

[34]林剑青，陈晓莹，贺竹梅.米曲霉与酱油曲霉高酶活菌株的诱变选育[J].中国酿造，2009，28（11）：24-27.

[35]傅力，章运，艾乃吐拉，等.酱油生产中高产蛋白酶菌株米曲霉UF366[J].食品科学，2008（9）：427-430.

[36]张贺迎，武金霞.用激活酿造法提高酱油的生产效率[J].中国调味品，2002（9）：22-23.

[37]何青，向洋，张京京.米曲霉酶活力与孢子特征关系的研究[J].中国酿造，1993，12（5）：33-37.

[38]沙惠琴，张彩莉，赵长新.米曲霉高产蛋白酶的工艺探索[J].中国酿造，2007，26（6）：44-46.

[39]张贺迎，武金霞，林彦彬.不同蛋白酶添加量对酱油成曲酶活的影响[J].中国酿造，2007，26（11）：43-44.

[40]SU N W,WANG M L,KWOK K F,et al.Effects of temperature and sodium chloride concentration on the activities of proteases and amylases in soy sauce koji[J].J Agr Food Chem,2005,53(5):1521-1525.

[41]NAKAHARA T,YAMAGUCHI H,UCHIDA R.Effect of temperature on the stability of various peptidases during peptide-enriched soy sauce fermentation[J].J Biosci Bioeng,2012,113(3):355-359.

[42]YOKOTSUKA T,IWASA T,FUJII S.Studies on high-temperature digestion of shoyu koji(part 1):(I)the role of glutaminase in shoyu brewing and(II)investigation for heat and salt resistant glutaminase producing microbes[J].J Jpn Soy Sauce Res Inst,1987,13:18-25.

[43]陈伯林.乙醇对酱油发酵体系中蛋白酶系的影响研究[J].现代食品科技，2011，27（10）：1192-1195.

Research advance on proteases system in soy sauce production

ZHANG Jinlan1,3,WANG Wenping2,WANG Fujie3,ZHANG Jian3,ZHAO Yan2,3*
(1.China Meat Research Center,Beijing 100068,China;2.Beijing Academy of Food Sciences,Beijing 100050,China; 3.Beijing Institute of Food&Brewing,Beijing 100050,China)

The proteases play the most important roles in soy sauce brewing,especially in the product quality and the cost.This paper summarized lots of research reports about the characterization of proteases,strains screening of high productivity of protease and the effective factors on the protease. In addition,the proteases purified in soy sauce brewing,the screening method of strains and the important influence on the enzyme activity in the production of soy sauce were summarized.The development trend of the soy sauce proteases in the future was also forecasted.

soy sauce;proteases system;protease activity

TS264.2

A

0254-5071（2014）11-0001-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.001

2014-09-19

国家自然科学基金项目（31171738）；国家高技术研究发展计划‘863计划’（2013AA102105）

张金兰（1984-），女，工程师，硕士，研究方向为酿造调味品。

*通讯作者：赵燕（1973-），女，高级工程师，硕士，研究方向为肉制品加工质量安全控制和清洁生产与节能减排。