阿托伐他汀对衰老大鼠多器官氧化应激指标的影响

张今尧，叶 平，王 浩，韩 磊解放军总医院 南楼心血管二科，北京 00853；海军总医院 航空潜水医学中心，北京 00037

人体衰老是一系列复杂的特定变化过程，主要表现为多器官功能减退，修复能力下降，易于向病态转化等[1]。研究证实，衰老增加机体氧化应激反应，产生多种炎症因子，增加细胞凋亡[2-4]。而他汀类药物对心血管保护具有多效性，包括改善血管内皮功能、降低血管炎症反应、抑制平滑肌增殖和免疫调节等。文献报道他汀类药物对除心脏外的肝、肾组织亦存在相似作用[5-6]。但上述作用对衰老个体是否仍有作用未见报道，他汀类药物对个体多器官氧化应激指标的观察亦未见报道。本研究通过动物实验，探讨衰老时机体内多器官氧化应激指标的变化，以及阿托伐他汀干预后的变化，揭示他汀类药物对机体多器官的作用机制。

材料和方法

1 实验动物 Wistar大鼠，自北京维通利华公司购入10月龄Wistar大鼠90只，饲养至20月龄，进行编号及称重。待上述大鼠饲养至24月龄时，购入3月龄大鼠30只，雌雄各半。

2 药品及试剂 阿托伐他汀大连辉瑞制药有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)、脂褐素(lipofuscin，LPF)检测试剂盒南京建成生物工程研究所。

3 实验仪器 台式高速离心机购自Sigma公司；高速冷冻离心机Heraeus Labofuge 400；微量移液器Gilson公司；显微镜Olympus BX40；荧光分光光度计RF-5301PC购自日本岛津公司。

4 分组及给药方案 将20月龄Wistar大鼠随机分为老年对照组、大剂量阿托伐他汀组和小剂量阿托伐他汀组，每组30只。将阿托伐他汀制成粉末后，加入0.9%氯化钠注射液，分别制成0.1 mg/ml及1 mg/ml混悬液。其中大剂量他汀组大鼠按照10 mg/(kg·d)给予1 mg/m l混悬液灌胃处理，小剂量他汀组大鼠按照1 mg/(kg·d)给予0.1 mg/m l混悬液灌胃处理。老年对照组大鼠根据体质量给予相应体积的0.9%氯化钠注射液灌胃。各组大鼠每周称1次体质量，根据体质量水平的变化调整给药剂量，各组大鼠灌胃4个月至24月龄。灌胃至24月龄时，老年对照组存活大鼠27只，小剂量阿托伐他汀组存活大鼠24只，大剂量阿托伐他汀组存活大鼠26只。另购入30只3月龄Wistar大鼠作为青年对照组，称重和编号后按上述标准予0.9%氯化钠注射液灌胃。

5 血液及组织标本留存 实验采用喂养至24月龄的老年对照组、大剂量他汀组、小剂量他汀组大鼠及新购入3月龄青年组大鼠。将大鼠固定于小动物实验台，采用10%乌拉坦腹腔注射麻醉(0.1 ml/kg)。依次分离大鼠颈部皮肤及皮下组织，以5 m l注射器自颈动脉抽取血液标本，于离心机中1 000 r/min离心15 min，取血清样本于-80℃冰箱中冻存备用。剪开大鼠胸部皮肤及胸、腹腔，迅速取出心脏、肝、肾，以预冷的0.9%氯化钠注射液冲洗血液后，以干净滤纸吸去残留的水分，放于标本盒中，迅速放入液氮中冻存备用。

6 检测指标 1)血清氧化应激指标的检测：取大鼠血清样本，按照试剂盒说明书操作。测定CAT、SOD、NOS、MDA含量。2)各组织氧化应激指标的检测：取大鼠各组织，以0.9%氯化钠注射液冲净血液后，用滤纸吸去多余水分，称重后放入匀浆器内，加入9倍于组织重量的预冷0.9%氯化钠注射液，在冰浴条件下匀浆，制成10%的组织匀浆液，于4℃条件下3 000 r/min离心15 min，取上清液。按照相应试剂盒说明书操作，测定相应组织SOD、MDA、CAT、NOS、LPF含量。

7 统计学处理 所有数据均用SPSS11.0统计软件处理，计量资料以-x±s表示，各组数据方差齐性，呈正态分布。统计学方法组间比较采用LSD-t检验法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠血清氧化应激指标变化 与老年对照组相比，青年对照组及大剂量他汀组血清中CAT、SOD、NOS均显著升高(P＜0.01)，MDA显著降低(P＜0.01)。与老年对照组相比，小剂量他汀组血清中CAT显著升高(P＜0.01)，MDA显著降低(P＜0.01)；NOS升高(P＜0.05)，SOD差异未见统计学意义。见表1。

2 各组大鼠组织中CAT变化 与老年对照组相比，青年对照组、大剂量他汀组中心脏、肝、肾中CAT均显著升高(P＜0.01)；小剂量他汀组中心脏及肾CAT显著升高(P＜0.01)，肝中CAT升高(P＜0.05)。见图1。

图 1 各组大鼠多器官CAT变化与老年对照组比较，a P＜0.01，b P＜0.05Fig. 1 Serum CAT levels in different groups a P＜0.01，b P＜0.05, vs elderly control group

3 各组大鼠组织中SOD变化 与老年对照组相比，青年对照组、大剂量他汀组中心脏、肝、肾中SOD均显著升高(P＜0.01)；小剂量他汀组中肝及肾SOD显著升高(P＜0.01)，心脏中差异未见统计学意义。见图2。

表1 各组大鼠血清氧化应激指标变化Tab. 1 Serum indications for oxidative stress in different groups(-x±s)

4 各组大鼠组织中NOS变化 与老年对照组相比，青年对照组、小剂量他汀组、大剂量他汀组中心脏、肝、肾中NOS均显著升高(P＜0.01)。见图3。

5 各组大鼠组织中LPF变化 与老年对照组相比，青年对照组、小剂量他汀组、大剂量他汀组肝、肾中LPF均显著降低(P＜0.01)。见图4。

图 2 各组大鼠多器官SOD变化与老年对照组比较， a P＜0.01Fig. 2 Serum SOD levels in different groups a P＜0.01, vs elderly control group

图 3 各组大鼠多器官NOS变化与老年对照组比较， a P＜0.01Fig. 3 Serum NOS levels in different groups a P＜0.01, vs elderly control group

图 4 各组大鼠多器官LPF变化与老年对照组比较， a P＜0.01Fig. 4 Serum LPF levels in different groups a P＜0.01, vs elderly control group

图 5 各组大鼠多器官MDA变化与老年对照组比较， a P＜0.01Fig. 5 Serum MDA levels in different groups a P＜0.01, vs elderly control group

6 各组大鼠组织中MDA变化 与老年对照组相比，青年对照组、大剂量他汀组肝、肾中MDA均显著降低(P＜0.01)；小剂量他汀组肝MDA显著降低(P＜0.01)，肾中差异未见统计学意义。见图5。

讨 论

目前，关于衰老的发生机制方面的学说之一为自由基学说。衰老的自由基学说最早由英国学者Harman[7]于1956年提出，其主要观点是机体在代谢过程中大量的内生自由基损害细胞是机体衰老的重要原因。由于许多体内的非自由基，如乙醛等也可导致细胞的氧化损害，故目前的衰老机制被认为是体内氧化物与抗氧化物间的失衡，即衰老的氧化应激学说[8]。当体内氧化物积聚过多时，DNA、线粒体等重要细胞结构受到损害，导致衰老发生[9-10]。而SOD、NOS等则可保护细胞免受氧化应激损害[11-12]。MDA、LPF作为反应机体氧化应激、衰老状态以及抗衰老干预措施效果的指标，已为广大学者所公认。既往的研究已证实，上述指标在生物体内的含量随年龄增加而逐渐增加[13]。此前韩磊等[14]采用与本实验相同方法，已明确与老年对照组相比，青年对照组及两种剂量阿托伐他汀组大鼠的心肌MDA、LPF含量显著降低。结合本实验结果提示，随机体的衰老，MDA含量增加，且此现象不仅存在于血清中，亦存在于心脏、肝、肾多器官内。随机体的衰老，LPF在多器官内的含量亦增加。而CAT、NOS、SOD等作为体内抗氧化物、改善氧化应激状态的主要因子，在实验研究中常被用来作为反映机体氧化应激水平、衰老情况的参照指标和评价抗衰老干预措施效果的指标。因此在本研究中，我们亦选择CAT、NOS、SOD作为反映老年大鼠多器官衰老状态的指标。由实验结果可知，同青年大鼠相比，老年大鼠血清及各组织内CAT、NOS、SOD的含量显著降低，这一结果表明24月龄的Wistar鼠多器官表现出了显著衰老的特点，并进一步说明衰老大鼠模型是成功的。

有研究报道，氟伐他汀对2型糖尿病合并高胆固醇血症患者具有抗氧化作用[15]。阿托伐他汀可以减轻血管紧张素Ⅱ介导的肝细胞炎症反应[5]。辛伐他汀在肝缺血再灌注过程中使过氧化氢酶含量升高[16]。阿托伐他汀可减少高胆固醇血症兔脂类过氧化物的水平[17]。在本研究中，给予阿托伐他汀干预后，大鼠多器官内的MDA、脂褐素水平均显著降低，而CAT、NOS、SOD活性显著增高。小剂量他汀组血清内SOD、心脏内SOD、肾内MDA较老年组无显著变化，但大剂量他汀组上述指标则出现显著变化，说明此效应可能与阿托伐他汀的剂量相关。此前Rinaldi等[18]发现辛伐他汀可剂量依赖性地增强小鼠肺、肝、肾多器官PPARα的表达，从而调节多种炎性因子，与本实验结果吻合。本实验提示，阿托伐他汀可以明显抑制老年大鼠多器官的氧化应激水平。同时也进一步提示，阿托伐他汀通过调节解体衰老过程中的氧化应激水平达到抑制衰老的作用。

最新的研究提示对于老年无心血管疾病患者，他汀类药物仍可减少心肌梗死及卒中的发生[19]。此研究一方面肯定了他汀对于老年患者的安全性，更重要的是提示绝大部分老年患者均可从他汀类药物中获益。本实验亦证实对于正常衰老研究对象，他汀类药物可对机体产生有利影响。但就本实验而言，部分小剂量他汀组指标与老年对照组相比差异未见统计学意义，可能与样本量相对较少有关，而大剂量他汀组较老年对照组各指标均有显著变化。综上所述，阿托伐他汀的长期干预可减轻氧化应激水平，起到抵抗多器官衰老的作用。

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