降钙素基因相关肽体外转染对大鼠移植供肺白细胞介素-10、肿瘤坏死因子-α表达的影响

赵 松 张 岩 任 爽 李向楠 朱登彦 赵 佳 黄 琪 吴 彬 卢家奇 吴 恺

(郑州大学第一附属医院胸外科 河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州大学肿瘤分子外科研究所 郑州市胸部肿瘤重点实验室，河南 郑州 450052)

通过构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的降钙素基因相关肤(CGRP)重组腺病毒载体(Ad5-CGRP-EGFP)，研究腺病毒介导CGRP转基因对移植供肺细胞因子白细胞介素(IL)-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α表达的影响。

1 材料与方法

1.1材料及试剂 河南省实验动物中心提供的20只SPF级健康Wistar大鼠250～300 g。酶联免疫吸附试验(ELISA)测定试剂盒和TNF-α、IL-10抗体购自Sigma公司。CGRP放射免疫分析试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。Ad5-EGFP购自广州生物基因科技发展有限公司。EGFP克隆基因能在异源组织中表达并可通过荧光显微镜观察其产生的荧光，可通过构建Ad5-CGRP-EGFP，观察CGRP基因表达。

1.2基因体外转染方法 采用离体供肺静脉逆行灌注转染空病毒载体和Ad5-CGRP-EGFP。在4℃低钾石旋糖苷(LPDG)液环境中，于获取供肺15 min后开始均匀灌注已用4℃ LPDG液稀释的空病毒载体和Ad5-CGRP-EGFP。灌注15 min，灌注压力20 cmH2O。完成灌注后夹闭肺动静脉，将供肺置于4℃ LPDG液保存，移植前以4℃ LPDG液冲洗肺血管床。

1.3实验分组 假手术对照组5只：直接开胸后游离左肺动静脉及主支气管，摘除左肺；空白对照组5只：4℃ LPDG液左肺动脉顺行灌注、左供肺离体肺静脉逆行灌注；空载体对照组5只：4℃ LPDG液左肺动脉顺行灌注、左供肺离体空病毒载体肺静脉逆行灌注；基因转染组5只：4℃ LPDG液左肺动脉顺行灌注、左供肺离体重组腺病毒载体肺静脉逆行灌注。空白对照、空载体对照、基因转染三组供肺均在4℃ LPDG液中保存12 h取材检测指标。

1.4检测指标 (1)CGRP放射免疫测定：留取标本制成匀浆。4℃ 3 000 r/min离心15 min。取上清液按试剂盒说明书测定肺组织CGRP。(2)ELISA测定TNF-α、IL-10表达水平：标本制成匀浆，按试剂盒说明书方法测定。(3)基因转染情况观察：标本留取后行冰冻切片，厚约8 μm，用CK40倒置相差荧光显微镜在蓝光下观察标本绿色荧光变化。

2 结 果

2.1放射免疫测定CGRP 假手术对照、空白对照、空载体对照、基因转染组分别为0、(1.51±1.15)pg/mg 、(1.66±1.52)pg/mg、(3.91±0.99)pg/mg。基因转染组较高于空白对照组、空载体对照组(P<0.05)。

2.2四组TNF-α水平表达 空白对照组〔(8.01±1.22)pg/mg〕、空载体对照组〔(8.18±1.38)pg/mg〕与假手术对照组(0)比较，TNF-α表达量明显升高(P<0.01)；基因转染组〔(2.92±1.76)pg/mg〕与空白对照组、空载体对照组比较，TNF-α表达量下降 (P<0.05)。

2.3四组IL-10水平表达比较 空白对照组〔(5.02±1.25)pg/mg〕、空载体对照组〔(5.61±1.19)pg/mg〕与假手术对照组比较(0)，IL-10表达量明显升高(P<0.01)；基因转染组〔(10.01±0.95)pg/mg〕与空白对照组、空载体对照组比较，IL-10表达量明显升高(P<0.05)。

2.4四组基因转染情况 假手术对照组、空白对照组两组无绿色荧光表现。空载体对照组和基因转染组可见血管内膜、中膜、外膜呈现绿色荧光，部分肺组织亦可见绿色荧光，表明已成功转染并表达绿色荧光蛋白。

3 讨 论

CGRP由37个氨基酸组成，是应用DNA基因重组和分子生物技术研究发现的第一种生物活性多肽，在肺、心血管系统具有重要的生理作用。CGRP对于肺移植中出现的血管反应、炎性病变和免疫反应等具有抑制、对抗作用〔1〕。

临床肺移植中，细胞因子在调节炎症过程中起关键作用，在肺组织低温缺血前期炎性细胞因子如TNF-α、干扰素(IFN-γ)等升高，而抗炎性细胞因子如IL-10、IL-12、IL-18水平下降。TNF-α是参与炎性损伤过程的重要细胞因子，可通过多种途径引起肺损伤。IL-10是重要的抗炎细胞因子，一方面能抑制炎性因子的合成和释放，另一方面直接抑制炎性细胞的激活、迁移和黏附，与其他抗炎介质有协同作用〔2〕。CGRP作为免疫活性物质可上调IL-10等抗炎性细胞因子，抑制TNF-α等炎性细胞因子，减弱抗原呈递，具有抑制炎症扩散的作用。

本研究表明Ad5-EGFP载体所承载的目的基因CGRP在延长保存12 h的移植供肺局部获得明显的表达。另外供体外CGRP转基因可减轻供肺炎症反应，可能与其下调前炎性细胞因子和上调抗炎性细胞因子介导的抗炎效应有关。

综上所述，CGRP通过抑制多核或吞噬细胞分泌TNF-α等炎性细胞因子，促进IL-10等抗炎性细胞因子分泌，抑制炎症反应〔1〕，从而发挥供体肺保护的作用。

4 参考文献

1陈 椿，陈道中，陈春美，等.降钙素基因相关肽体外转染对大鼠同种异体肺移植物缺血再灌注损伤的影响〔J〕.中华实验外科杂志，2008;25(11)：1469-71.

2李劲松，聂 君，陈 刚，等.大鼠肺缺血再灌注损伤不同时期基因表达谱的改变〔J〕.中华实验外科杂志，2008;25(2)：200-2.