Cox-2在结直肠癌中的表达

孟 韬 张大伟 刘林涛 吴 娜 杨晓波

(吉林省人民医院，吉林 长春 130000)

结直肠癌(CRC)是我国常见的恶性肿瘤之一，近年来患病率逐年上升。由于术前早期诊断较为困难，术后判断复发困难，对CRC的化疗效果也不十分满意。环氧化酶(COX)是一种双功能酶，是花生四烯酸代谢为前列腺素类的关键限速酶。COX-2是COX中的一个亚型，在正常组织和情况下不表达，但可被广泛的血管内外激活物质诱导产生，与CRC的发生发展及肿瘤的侵袭和转移密切相关。

1 材料与方法

1.1临床资料 选自吉林省人民医院肛肠科2010年1月至2012年5月CRC手术标本50例，分别取淋巴转移癌组织30例，未转移癌组织20例，正常结肠黏膜组织10例，正常的结肠黏膜组织取自远离CRC组织10 cm以上处，并在术后1 h内将标本归类分组存于液氮。入选标准：(1)所有病例均行CRC根治术，标本由经验丰富的病理医师给出病理诊断并统计；(2)所有病例均具有完善的临床资料并由专业人员统计；(3)术前未经放化疗等系统治疗；(4)没有其他恶性并发症；(5)术前未经非甾体抗炎药(NSAIDs)治疗。其中男33例，女17例。年龄35～84(平均60)岁。组织学类型均为腺癌。肿瘤直径<5cm 22例，肿瘤直径≥5cm 28例。TNM分期参照2009年UICC、AJCC CRC TNM分期(第7版)，其中T1和T2期10例，T3期30例，T4期10例。50例CRC标本中，术前癌胚抗原(CEA)表达阳性42例，阴性8例。分化程度：高分化(含高-中分化)腺癌16例，中分化腺癌25例，低分化(含中-低分化)腺癌9例。有淋巴转移(淋巴结、神经、脉管侵犯)25例。

1.2主要试剂及仪器 RNA提取试剂Trizol美国进口；逆转录试剂盒购于大连Takara公司；荧光染料试剂盒购于大连Takara公司。LightCycler Real-time PCR扩增仪(Roche Diagnostics公司，瑞士)；高速台式离心机：湘雅仪表厂；紫外分光光度仪(LKB.BIOCHROM.ULTROSPEC Ⅱ，日本)。

1.3实验方法

1.3.1实验分组 根据结直肠癌病例的病理结果，以是否有淋巴转移为分组标准，分为淋巴转移癌组织30例，未转移癌组织20例，正常结肠黏膜组织10例。

1.3.2实验步骤 Trizol法提取组织总RNA；逆转录(RT)；Real Time PCR 反应。

1.3.3实验结果分析 反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和熔解曲线，熔解曲线证实产物中不存在二聚体。使用LightCycler Software4.0(Roche)软件进行数据分析，采用2-△△CT的方法分析各基因相对表达量。

2 结 果

Real time PCR扩增结果显示，在癌旁结直肠正常黏膜组织(表达量设为1)、无淋巴结转移的结直肠腺癌(表达量3.5±0.8)与有淋巴结转移的结直肠腺癌(表达量7.2±0.9)三组之间COX-2表达水平有明显差异(P<0.05)。COX-2基因表达从结直肠正常黏膜组织→无淋巴结转移的结直肠腺癌组织→有淋巴结转移的结直肠腺癌组织呈现逐渐增高的趋势，各个阶段两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

大量的流行病学研究证实，NSAIDs具有明显的降低CRC发病率及病死率的作用。而经研究发现NSAIDs类药物主要是通过抑制COX-2来发挥作用的。

COX又称为前列腺素内氧化酶还原酶，兼有环氧化酶活性和过氧化氢酶活性，是生成前列腺素的关键限速酶。COX-2于1989年由Simmons等发现。在正常情况下，C0X-2除在脑、肾等器官表达很少量之外，其他器官基本上不表达，但在细胞外因子、癌基因或者致癌物的刺激下能迅速产生〔1〕。

目前监测COX-2表达水平有以下三种方法：(1)直接测定COX-2蛋白的表达，如免疫组化、Western-印迹；(2)直接测定COX-2的基因表达，如Reverse-Transcription Polymerase Chain Reactin(RT-PCR)、Northern blots；(3)通过检测COX-2相关酶和COX-2产物后间接测定COX-2的表达，比如通过检测PGE2量来测定COX-2的表达。此法所获得数据比较准确，不足之处就是对标本的要求较高，费用也比单纯免疫组化昂贵。

Sano等〔2〕研究指出COX-2蛋白在正常结肠黏膜组织、结肠腺瘤、CRC中的表达逐渐增高。徐菁等〔3〕研究指出COX-2与CRC的Dukes分期和是否发生淋巴转移相关，而与其组织分化程度无关。本研究结果提示COX-2有促进CRC侵袭和转移的潜能，即过表达COX-2的CRC具有更强的侵袭性，这为判断CRC是否发生转移和预后提供了一种重要的思路。

Eberhart等〔4〕发现，COX-2可上调肿瘤细胞CD44的表达，CD44可以促进细胞与细胞之间和细胞与细胞外基质之间的黏附，从而促进了CRC的转移。Tamazawa等〔5〕发现COX-2可促进CRC细胞向基底膜和内皮细胞的黏附而增进肿瘤细胞的转移。提示COX-2可直接通过改变肿瘤细胞表型来促进肿瘤转移〔4〕。高表达的COX-2可产生大量的PGE2，具有免疫抑制作用，使肿瘤细胞逃避免疫监视，从而促进了CRC的发生发展。Masunaga等〔6〕发现了COX-2与毛细血管密度(MVD)显著相关，MVD和肿瘤发生发展呈正相关，提示COX-2和CRC的发生发展关系密切。COX-2可促进促血管生长因子(VEGF)表达〔7〕，而VEGF可促进肿瘤新生血管形成，新生的毛细血管基底膜不连续，肿瘤细胞易于突破，最终促成了肿瘤细胞生长和转移〔8〕。

淋巴转移仍是大多数上皮来源的肿瘤转移的主要途径，但目前对恶性肿瘤如何发生淋巴转移及影响因素仍不太明确。Dhar等〔9〕利用转染了COX-2基因的CRC细胞株，发现能够显著提高VEGF-C的表达，而利用COX-2特异性抑制剂则能降低VEGF-C的表达。VEGF-C是人类发现的第一个淋巴管生长因子，是血管VEGF的成员之一。研究发现，VEGF-C与多种肿瘤的淋巴管浸润和淋巴结转移呈正相关。胡玉林等〔10〕发现在未发生淋巴管浸润或无淋巴结转移的肿瘤组中VEGF-C表达率均显著低于发生了淋巴管浸润及淋巴结转移肿瘤组。VEGF-C通过与淋巴管上的特异性受体VEGFR-3结合后促进肿瘤淋巴管生成并改变淋巴通路通透性，从而促进了CRC的转移〔11〕。COX-2的过表达可以促进VEGF-C在肿瘤细胞的表达，从而促进了CRC的淋巴管形成和淋巴结转移。

COX-2全程参与从结肠正常黏膜-CRC-CRC转移变化的整个过程，在这多步骤、多阶段的变化过程中发挥了重要的作用。转移性的CRC过表达COX-2，而高表达的COX-2则可促进CRC淋巴管的生成和淋巴转移、血行转移及远处转移，抑制机体的免疫反应，促进了肿瘤的转移和复发。研究揭示了COX-2与CRC的相互关系及作用机制能够帮助人类认识肿瘤的本质，研制针对COX-2的特异性药物能够降低COX-2的表达，抑制肿瘤生长和转移，显著的降低CRC的发生率及病死率〔12〕，这些都具有重要的理论和现实意义。

4 参考文献

1刘晓斌，刘 涛，刘永仙，等.CerbB-2 与 p16 蛋白在大肠癌组织中的表达及其意义〔J〕.陕西医学杂志，2009；38(11)：1478-9.

2Sano H，Kawahito Y，Wilder RL，etal.Expression of cyclooxygenase-1 and -2 in human colorectal cancer〔J〕.Cancer Res，1996；56(11)：2556-60.

3徐 菁，李士瑛，兰向昀.环氧化酶-2，c-erbB-2和Ki67在结直肠癌中表达及其临床意义〔J〕.解剖学杂志，2005；28(3):287-9.

4Eberhart CE，Coffey RJ，Radhika A，etal.Up-regulation cyclooxgenase-2 expression in human colorectal adenomas and adenocarcinoma〔J〕.Gastroenterology，1994；107(3)：1183-8.

5Tamazawa S，Tsuno NH，Sunaml E，etal.Cyclooxgenase-2 overexpression correlates with tumor recurrence，especially hematogenous metastasis，of colorectal cancer〔J〕.Br J Cancer，2000；61(3)：324-8.

6Masunaga R，Kohno H，Dhar DK，etal.Cyclooxgenase-2 expression correlates with tumor neovascularization and prognosis in human colororectal carcinoma patients〔J〕.Clin Cancer Res，2000；6(20)：4064-8.

7Liu XH，Kirschenbuam A，Yao S，etal.Up-regulation of vascular endothelial growth factor by cobalt chloride-simulated hypoxia is mediated by persistent induction of cyclooxygenase-2 in a metastatic human prostate cancer cellines〔J〕.Clin Exp Metastasis，2002；17(8)：687-94.

8李惠翔.乳腺癌 TP，TS mRNA 及蛋白表达与临床病理、预后关系的研究〔J〕.郑州大学学报，2004；39(2)：1998-2020.

9Dhar DK，Kubota H，Kotah T，etal.Tumor vascularity predicts recurrence in differentiatied thyroid carcinoma〔J〕.Am J Surg，1998；176(5)：442-27.

10胡玉林，曹慧秋，吴海燕，等.E-cadheria和VEGF-C，D的表达及BMVD和LMVD与无淋巴结转移结肠癌复发的关系〔J〕.中国普通外科杂志，2010；19(5)：529-34.

11Tsujii M，Kawano S，Tsujii S，etal.Cyclooxgenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cells〔J〕.Cell，1998；93(5):705-16.

12Thun MJ，Namboodiri MM，Calle EE，etal.Aspirin use and risk of fatal cancer〔J〕.Cancer Res，1993；53(6)：1322-7.