微生物原生质体融合育种技术及其应用研究进展

2014-01-27刘敏跃

中国饲料 2014年7期

刘敏跃，李鹏，龙淼＊

（1.辽宁省农牧业机械研究所有限公司，辽宁沈阳 110036；2.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110161）

原生质体融合是20世纪70年代发展起来的基因重组技术，具有许多常规杂交方法无法比拟的独到优点：（1）克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。（2）基因重组频率高，重组类型多。（3）可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。（4）存在着两个以上亲株同时参与的融合，可形成多种性状的融合子。同基因工程方法相比，这一技术不需对试验菌株进行详细的遗传学研究，避免了分离提纯、剪切、拼接等基因操作，也不需高精尖的仪器设备和昂贵的材料费用等（罗雯和陈志勤，2003）。随着生物学研究手段的不断创新，原生质体融合技术的基本实验方法逐步完善。经过多年的实际应用证明，微生物原生质体融合是一项十分有用的育种技术（Kim 等，2000）。

1 原生质体融合方法

1.1 化学法——PEG结合高Ca2+法亲本原生质体制备好后，即可进行融合，但在自然条件下虽然也可融合，但融合率极低。自从1974年Kao和Michayluk用聚乙二醇（PEG）诱导大麦、大豆等植物原生质体融合后，PEG很快用于微生物细胞的原生质体融合。其融合效率高，适用范围广，在各类微生物细胞原生质体的融合中广泛使用。

1.2 电融合原生质体电融合是始于20世纪80年代的细胞改良技术。这一技术将电学与生物化学相结合，产生了缓和而高频率的原生质体融合效果。实践证明，该技术不但广泛用于动物和植物的细胞融合，而且在各类微生物细胞的改良中也十分有效。如原核微生物克氏固氮菌与枯草芽孢杆菌的原生质体融合；真核微生物中的酵母菌、霉菌中的黑曲霉以及食用真菌中的蘑菇等均有原生质体电融合的报道。

1.3 激光诱导融合 1987年利用激光诱导融合的技术迅速发展起来，并很快被应用在动物细胞及植物原生质体融合中，后来又被用于微生物原生质体融合中。激光融合的优点是毒性小、损伤小，但由于其所需设备昂贵复杂，操作技术难度大，很难推广应用。在微生物原生质体融合中应用激光微束技术，融合效率低，且丧失了高度选择性的优点，有赖于后续步骤检出融合子。因此，激光诱导融合技术仍处于发展初期，还有待于进一步完善。

2 原生质体融合子筛选方法

融合体中除重组体外，还有异核体或部分结合子、杂合二倍体或杂合系，这些都会在平板上形成菌落，检出融合体的方法有多种，在育种工作中可根据实验目的和微生物不同加以选择。

2.1 利用营养缺陷型标记筛选融合子这是常见而有效的传统选择标记方法，其检出设计原则是将亲本菌株诱变处理后产生对某些营养物质合成途径受阻的突变株，在分离的培养基上只有融合子生长而不能让突变的双亲本原生质体形成菌落。融合的双亲带有不同营养缺陷型标记，原生质体融合处理后的混合物直接分离到基本培养基上就可以检出融合子。

2.2 利用抗药性标记筛选融合子微生物抗药性是菌种的重要特性，是由遗传物质决定的，不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异，利用这种差异即可对融合子进行选择。Bradshaw Perdy首先用这种方法检出了融合子。他们以Apergillusrugulosus（营养缺陷型，吖啶黄抗性）和Apergillusrugulosus（原养型，吖啶黄敏感）为双亲本，经原生质体融合处理后在含有25 μg/mL或50 μg/mL吖啶黄的基本培养基上检出融合子。但应用此法须注意药物浓度，过高会使融合频率降低，过低则会使亲本生长，影响融合子的检出。

2.3 利用荧光染色法筛选融合子荧光染色法是事先将双亲染色而携带不同荧光色素（DAPI，FTTC）标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下，挑取同时带有双亲原生质体荧光标记的融合子，直接分离到再生培养基上再生，最后得到融合子。本法简便易行，保持了亲本的优良遗传特性，是融合子选择法的发展趋势，但对仪器设备要求高，且费用高，有条件的实验室采用此法能提高融合效率。

2.4 利用灭活原生质体标记筛选融合子利用灭活原生质体标记筛选融合子的原理是在原生质体融合之前，对单亲或双亲原生质体进行灭活，使其丧失再生的能力，当与另一亲株融合后，代谢上得到互补，能够存活。灭活的方法很多，主要有热灭活法和紫外灭活法，某些化学药剂（如碘乙酸）灭活法等。将融合亲本之一原生质体灭活，即可根据另一亲本的特性设计选择条件筛选融合子。由于灭活原生质体融合减少了寻找稳定遗传标记的繁琐工作及由此可能带来的亲株优良性状的丢失，因此是获得遗传重组的一条有利途径；而且在不利用选择培养基的情况下即可减少亲株的生长，从而提高了筛选效率，因而在融合子筛选上的应用也较为广泛（王燕，2007；高玉荣等，2006），但灭活法的不足之处是融合频率下降。

2.5 双亲对碳源利用不同而检出融合子利用亲株对各种碳源利用差异，结合其他特性分离筛选出融合子。如酿酒酵母89-1为呼吸完整，不能利用木糖，对放线菌酮敏感的一株酵母菌。另一株亲株是经诱变剂处理后的呼吸缺陷型菌株，但能够抗20 μg/mL放线菌酮。当这两亲本融合后，融合子能在含有木糖和20 μg/mL放线菌酮的选择培养基上生长。通过此方法可将融合子筛选出来，但此法适应的菌种范围相对较小。

2.6 融合子的其他筛选方法以上几种方法可以较准确地选出融合子，还有一些辅助性方法可用于融合子的检测。虽然用这些方法单独定论是否为融合子证据不充分，但他们各自都从不同方面证实融合发生，因而常被用作非人工标记鉴别融合子的辅助性方法，主要用于：（1）对昆虫的毒力测定进行融合子的选择；（2）利用形态差异选择融合子，这一方法首先要求所采用的菌株具有可供肉眼直接观察的形态学差异，目前只有在青霉的育种过程中采用这种方法；（3）生化测定指标选择融合子，通常测定的生化项目有DNA含量、氨基酸含量、酸性磷酸酶、同工酶和电泳等。一般来说，融合子的DNA含量高于任何一个亲本的DNA含量，但却少于双亲DNA含量之和。融合子与双亲氨基酸含量百分比不同，融合子和亲本的酸性磷酸酶同工酶和酯酶同工酶酶谱电泳结果也不同。

以上是一些常见的融合子筛选方法，实际应用中往往是将上述这些方法进行结合使用。如将营养缺陷型与抗药性、抗药性与原生质体灭活等相结合选择融合子。

3 原生质体的鉴定方法

原生质体融合过程中，先是细胞质融合然后才是细胞核融合，所以融合产物可能有两种：合核体（细胞质和细胞核产物）和异核体（细胞质融合产物），前者遗传稳定，为真正的融合子，后者不稳定，容易发生性状分离。因此，要得到真正的融合子，必须进行数代的自然分离和选择鉴定（陈代杰和朱宝泉，1994）。融合子的鉴定一般从形态学、生理生化特性、生长速度、生物量、遗传学（基因型、核型、DNA含量、GC比等）和同工酶等分析实现。近年来，也有人通过DNA限制内切酶酶切片段图谱比较、核苷酸序列分析、分子杂交、RAPD技术等分子生物学方法来鉴定融合子（孙剑秋和周东坡，2002）。

菌落形态观察：采用巨大菌落法。融合产物在平板上长出的菌落形态一般有两种：两亲本类型和非亲本类型，后者很可能就是融合子。

菌体形态观察：融合子在传代初期，细胞形态差异很大，随着传代次数的增加，细胞形态趋于稳定。

菌体细胞大小：一般用显微测微尺分别测量亲株和融合子的长轴、短轴，按公式：V=4/3·π·a/2·（b/2）2计算。研究表明，融合子细胞体积并非为两亲株细胞体积之和，而是略大于或介于两亲株之间。有研究发现，融合子的细胞体积在传代过程中有逐渐缩小的趋势，一般恢复到与亲本大小相近的程度，但轴比及体积仍与同亲本有一定差别。

DNA含量：有的融合子DNA含量接近两亲株DNA含量之和，有的介于两亲株之间。这种现象一般认为是由于融合子在传代稳定过程中部分亲本染色体丢失引起的。

生理生化特性：优良的融合子应兼具双亲的优良特性。对融合子生理生化特性的分析一般针对两亲株生理特性的差异进行，包括生长温度、耐酒精浓度、碳源/氮源底物分解利用情况、营养需求等。

核染色：融合过程中，两亲株原生质体在促融因子作用下先发生凝集、接触，再进行细胞质融合，进而可能发生核融合。所以在选择培养基上长出的融合产物有两种：真正的融合子（细胞质和细胞核都发生了融合）和异核体（只有细胞质发生了融合）。Gimsa染色、Feulgen染色、苏木精染色或 4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）荧光染色都能清楚地看到核相，从而使异核体得到排除（焦瑞身，1989）。

同工酶电泳：一般通过乙醇脱氢酶同工酶、酯酶同工酶电泳对融合产物加以鉴定。若融合物具有两亲株的谱带，则可证明是真正的融合子。

4 原生质体融合育种技术的应用

4.1 在抗生素生产上的应用原生质体融合技术不仅可用于提高抗生素的产量，同时还可用于融合子产生新的抗生素的研究。柳君科（1989）将产生庆大霉素的棘孢小单孢菌（Micromonospora ech inospora）与链霉素产生菌灰色链霉菌素（Streptomyces griceus）进行原生质体融合，其融合子产生庆大霉素的产量比亲本菌明显提高。贺敏霞等（1989）通过将诺卡氏菌原生质体融合重组得到了一株简体转化活力明显高于亲本的融合子。林荣团和杨毓芬（1990）以天然无抗菌活性的变青链霉菌1326与链霉菌1254营养缺陷型突变株进行种间原生质体融合，从755株融合体中筛选到5株抗菌活性较稳定的菌株。徐京宁等（1992）将金色链霉菌（Streptomuces.au reofaciens）和林可链霉菌（Streptomycesl incolnensis）的原生质体融合，其融合株能在孢内积累一种新的具抗菌活性的物质，其性质不同于两亲株所产生的抗生素金霉素和林可霉素。曾洪梅和张震霖（1995）通过原生质体融合的方法提高了农抗武夷菌素的效价。朱昌雄和李永慧（1996）通过对中生菌素高产菌株采用原生质体融合等4种育种方法，结果表明所用方法都能有效地提高中生菌素产生菌的效价。陈五岭（1997）对金霉素链霉菌和龟裂链霉菌原生质体融合，融合子产抗生素能力及遗传稳定性均优于金霉素链霉菌。王金盛和李春波（1998）用电场诱导棘孢小单胞菌原生质体融合，得到产小诺霉素（MCR）量高于亲株的融合子。

4.2 在防治动物疾病上的应用王兴龙等（1994）进行了多杀性巴氏杆菌×73株与P1059株原生质体融合株的构建，融合株兼具有两亲本株的抗原性和双抗药性，从而为研究新型的禽多杀性巴氏菌双价菌苗奠定了基础。张元和等（1995）进行了痢疾杆菌P15和E弧菌8822原生质体融合的初步研究，获得兼有两亲株遗传性状的融合子。任涛等（1998）进行了大肠杆菌O2（Norr，Chls）、O78（Chlr，Nors）原生质体制备和再生。蒋文泓和黄青云（1999）以耐药标记的禽多杀性巴氏杆菌5A弱毒菌株与禽大肠杆菌02弱毒菌株作亲本进行原生质体融合后再生，成功地获得3株具有双亲本耐药性和双菌体血清型的融合菌株，获得具有多种疾病免疫力的疫苗生产菌株。吴孔兴等（2002）进行了禽巴氏杆菌、大肠杆菌融合二联弱毒菌株的培育。钟蕾等（2002）进行了肠型点状气单胞菌和鱼害黏球菌融合子的构建，获得了制备这种融合疫苗的遗传性稳定的融合菌株。这些都为动物疫病防治探索出了一条新的途径。

4.3 在改良菌种及优化菌种特性上的应用许多微生物能在较高的温度下生存，有的能在45～65℃甚至更高温度下生长。有的耐热菌可在98℃的温泉中生长繁殖。这种耐热特性在工业上具有很重要的应用价值，比如在酒精酿造中，酿酒酵母在40℃时产酒率明显下降，要降低发酵液的温度，必须消耗大量能源，因为在纤维素类物质同步糖化发酵（SSF）过程中制约反应效率的一个重要因素是纤维素酶的最适温度同酵母发酵的最适温度的不一致性，纤维素酶的最适温度为45～50℃，而酵母发酵的控制温度一般在30℃左右，选用耐高温酵母菌株是解决纤维素同步发酵中这两个温度不协调的有效方法。Seki等（1983）、方霭祺和李绍兰（1990）通过原生质体融合分别获得了42℃条件下发酵产酒精体积分数为6.0%和40℃发酵产酒精体积分数为5.9%的耐高温酵母。文铁桥和赵学慧（1999）通过耐高温的克鲁维酵母和产酒率高的酿酒酵母进行属间原生质体融合，获得了在45℃下发酵产酒精体积分数为7.14%的融合子。孙君社等（2002）通过原生质体融合获得了在固态发酵45℃时产酒能力达到体积分数为7.28%的融合子。

由于自身生长条件的限制，许多菌种如双歧杆菌是严格的厌氧菌，生长相对缓慢，需经F6PPK的特殊途径发酵葡萄糖，对氧极为敏感，暴露在空气中易死亡，给双歧杆菌微生态制剂的生产、开发带来困难，其制剂中的活菌数也难以长时间维持，极大地限制了其在食品工业中的应用。张莉滟和张德纯（2003）将兼性厌氧菌保加利亚乳杆菌热灭活的原生质体作为遗传物质供体，采用电融合方法，诱导其原生质体与双歧杆菌融合，将其耐氧基因随机整合到长双歧杆菌中，提高了其耐氧能力。黎永学等（2002）将双歧杆菌和酿酒酵母原生质体融合，初筛出具有双歧杆菌和酿酒酵母生物学特性、较稳定的融合细胞株BSF1和BSF2，克服了双歧杆菌因厌氧而不易开发利用的难题，为益生菌种的改良提供了新思路。

嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）是人和动物肠道中重要的微生物，口服乳酸菌需要菌体能够通过低pH胃液存活下来，还要耐受肠道内的胆盐浓度，但不是所有的嗜酸乳杆菌都能耐受低pH和高浓度胆盐环境，王玉华等（2006）利用原生质体融合技术获得一株能耐酸耐胆盐能力强的菌株La-F1，并且其生长特性符合乳酸发酵食品的要求，也可用在发酵肉制品、医药和饲料工业中。

5 原生质体融合育种存在的问题

原生质体融合技术虽取得了较大的发展，但也存在着许多问题和困难。虽然细胞融合阶段不存在异种间的任何不亲和性，但在核融合染色体交换、杂交，以及融合杂种细胞随后的发育过程中，远源物种之间仍存在着严重的不亲和性和排斥性，有时并未发生真正的核融合，两亲本的染色体是相互保守甚至是排斥的，它们所带的基因无法在一个细胞中同时表达出来，最终产生了分离。原生质体融合技术的另一困难是杂种鉴定问题。杂种鉴定往往需要从遗传、生化等方面获得有利的证据。所以首选两亲本也应有某些生化或遗传标记，但在自然界带有这类标记的细菌很少，虽可通过人工诱导产生突变体，而获得一个真正的突变体不经过几年的时间是无法获得的，而单亲灭活原生质体可显著缩短融合工序和时间，提高筛选效率，但融合的频率明显降低。

6 小结

综上所述，原生质体融合技术为遗传操纵、分子生物学和基础理论研究提供了一种重要工具，也为遗传育种改良提供了一种有效手段，现已广泛应用于各个领域，尤其为微生物育种提供了一种简洁而高效的方法。

目前，原生质体融合技术发展迅速、应用广泛，已经成为遗传育种的重要手段，寻找具有更高融合效率的方法有着重要意义。如基于微流控芯片的原生质体融合技术、高通量原生质体融合芯片、空间原生质体融合技术、离子束原生质体融合技术和灭活原生质体融合技术相继被提出并被应用于遗传育种中。而且高通量原生质体融合芯片可以与化学诱导融合、电融合等方法相互结合，这些技术将在未来原生质体融合育种方面的研究中发挥重要作用，相信随着融合技术的不断完善，原生质体融合技术在遗传育种中的地位将会越来越重要（王登宇等，2008）。

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