肌萎缩侧索硬化的基因治疗

陈章洲 徐仁伵

(吉安市泰和县人民医院内科，江西 泰和 343700)

肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种进行性神经变性疾病，由于上、下运动神经元变性导致延髓、四肢、躯干等部位肌肉逐渐无力和萎缩，确诊后3～5年患者多因呼吸肌麻痹而死亡，目前尚无有效的治疗方法。利鲁唑(riluzole)为谷氨酸拮抗剂，可使ALS患者的生存期平均延长3 个月以上，是目前唯一被美国FDA 批准的临床药物。其他的治疗措施还包括维生素、神经营养因子及干细胞移植等，但都没有确切效果。基因治疗为治疗ALS提供新的治疗策略。

1 ALS发病机制

虽然ALS有特定的致病基因，但其发病仍与多种因素的互相影响有关。大约20%的家族遗传性ALS(fALS)与铜/锌超氧化物歧化酶-1(SOD1)基因突变有关，约5%与编码TDP-43蛋白的TAR DNA结合蛋白(TARDBP)基因突变有关。近年来研究发现了更多与ALS患者相关的基因突变，如血管生成素(ANG)基因、囊泡相关膜蛋白相关蛋白B(VAPB)基因和脂肪肉瘤融合(FUS/TLS)基因〔1，2〕。不论散发性ALS(sALS)是否存在上述基因突变，但都有共同的病理特征，即运动神经元选择性死亡、氧化应激、神经纤维异常、兴奋性氨基酸毒性、细胞凋亡、线粒体功能障碍、轴突运输障碍、RNA结合蛋白的基因突变和炎症因素都在ALS发病过程中起到作用。近年来，由于神经遗传学研究的进展，ALS发病机制的进一步阐明，导入外源性基因载体的改进及其基因转移技术的进步，使基因介导的治疗正逐步实现。

2 基因治疗的靶向选择

2.1星形胶质细胞 尽管在ALS中选择性易损细胞为运动神经元细胞，但星形胶质细胞可激发运动神经元的凋亡及炎症反应〔3～5〕，在疾病的发展过程中也起到调节作用。降低星形胶质细胞中谷氨酸转运体水平可以导致ALS患者谷氨酸摄取障碍及继发的兴奋性毒性作用。兴奋性氨基酸受体(EAAT2)主要表达于星形胶质细胞，而EAAT2被抑制则是运动神经元细胞兴奋性毒性的一个原因。在体外培养的研究中，大量表达EAAT2可以显著增加谷氨酸的摄取率及提高运动神经元神经保护作用。SOD1小鼠的EAAT2增加可延缓其运动神经元细胞的丢失，若受体减少则在早期即表现出运动神经元细胞的丢失〔6〕。由此可见增加胶质细胞谷氨酸受体的表达有助于ALS的治疗。尽管此结论在目前基因治疗领域并未应用，但通过在病灶区增加正常星形胶质细胞以清除过量谷氨酸的细胞治疗方式已被推荐〔7〕。

2.2神经肌肉接头 因为终板的失神经支配为ALS的最初变化之一〔8〕，在早期即着眼于神经肌肉接头则成为保证运动神经元间联系的重要方式〔9，10〕。对初生的SOD1转基因小鼠肌内注射以腺病毒为载体整合的心肌营养因子-1，可延缓神经肌肉变性。同样体外神经胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)的肌肉注射，在SOD1转基因小鼠疾病中期阶段亦可增加神经肌肉连接和运动神经元数量〔11〕。近期有研究证明对初生转基因小鼠进行全身肌肉注射表达抗SOD1的腺病毒相关载体AAV6，可阻止肌肉萎缩但不能阻断疾病的进展〔12〕。

综上所述，对于ALS要同时针对脊髓(如运动神经元细胞及胶质细胞)和骨骼肌(如神经肌肉接头)进行治疗才有可能更全面得阻止运动神经元的变性。

3 动物模型

目前以啮齿类动物为模型的研究已广泛开展，虽然已有可延长动物存活期及阻止神经元丢失的报道，但治疗与动物模型的相关性仍存置疑，因为绝大多数干预都在动物发病以前进行，而ALS患者却已有明确临床表现。除了现已熟悉的SOD转基因小鼠，动物模型也需要多元化。目前已有以猪作为SOD转基因的大动物模型，另也存在类似于ALS患者延髓麻痹的自发性喉部麻痹的犬类〔13〕及存在SOD1基因错义突变的脊髓变性犬类亦可作为ALS可能的大动物模型，这些多元化的动物模型有利于进行ALS包括基因治疗的在内的各项研究。

4 给药途径

基因治疗的途径分为体外细胞介导法(ex vivo)和体内直接转染法(in vivo)。ex vivo是指将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞(或异种细胞)，经体外细胞扩增后，输回人体，此途径比较经典、安全，而且效果较易控制，但是步骤多、技术复杂、难度大，不容易推广；in vivo 途径是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA。此途径操作简便，容易推广，但目前尚未成熟，存在疗效持续时间短，免疫排斥及安全性等一系列问题。

ALS基因治疗的疗效与以何种方式将转基因物质充分转染运动神经元细胞直接相关，而且其组织内分布的弥散程度也决定了可能达到的最佳疗效。事实上，在ALS基因治疗的临床实践中，以何种途径可以将安全有效的基因转递至脊髓运动神经元，且呈弥散性分布，仍是一极大的挑战。

近年来已有不少有关于ALS基因治疗给药途径的研究。但在鼠类行之有效的非侵入性肌肉注射和神经内注射在大动物模型中并未得到放大验证，这可能与转运载体无效和基因在脊髓的表达有限相关。目前已有研究证明对猴子行肌肉注射AAV6介导的基因后可得到大量的表达〔14〕，但对已累及远端轴索的患者是否可行仍待考究。另外可将基因更直接地转移至脊髓的椎管内注射，虽然在野生型SOD1动物中已卓有成效〔15，16〕，但尚未得到临床验证。有学者正在对ALS患者椎管内注射进行1期临床研究，不过安全性问题仍阻碍了其发展〔17〕。因肌肉、神经、椎管内注射途径均不能将基因转移至整个脊髓，仅仅可作为局限性基因传递方式。

当前ALS基因治疗的研究主要集中在以腺病毒为载体的AAV9，它可经静脉或鞘内注射通过血脑屏障且对运动神经元有一定的选择性〔18～20〕。另外还有一些学者〔18，21～23〕在大动物模型中研究以这种载体及其弥漫性非侵入性注射后的基因表达情况。

5 外源基因及载体

5.1神经保护作用 目前已证实对啮齿类ALS动物模型中濒死运动神经元细胞进行保护可延长其存活期，这也是有关ALS治疗研究的前提。但对于ALS患者进行全身注射脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)或类胰岛素样生长因子(IGF)-1却无获益〔24，25〕。可能与注射的不恰当或不足量致其失活或缩短其半衰期有关。但以基因转染方式给予神经营养因子则是更有效的方法。

5.2病毒载体转运胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、IGF-1、血管内皮生长因子(VEGF)等 AAV和慢病毒载体能作用于非分裂相细胞，而且能与宿主细胞基因组发生整合。以病毒介导基因转染的方法为一种中枢神经系统退行性病的潜在治疗方案，目前已有学者〔26～28〕在对帕金森病及阿尔茨海默病进行临床实验，以评估此方式转递神经营养因子的安全性及治疗前景。动物模型中分泌的神经营养因子可保护疾病状态下的运动神经元细胞并延缓病程发展的大量论证是对ALS患者以基因方式转染神经营养因子进行治疗的理论基础。在sALS啮齿类动物模型中有大量成功的案例证明病毒介导转染GDNF、IGF-1和VEGF对运动神经元有保护作用。这些SOD1转基因动物模型的性状与ALS患者的临床表现类似。而用以转染靶细胞的神经营养因子对SOD1鼠起病时期及病程进展的推迟程度，或多或少与其给药途径有关。

研究表明，发育及成熟运动神经元对BDNF、人神经营养因子(NT)-3、NT-4/5有反应，BDNF、NT-3增加培养胎大鼠运动神经元的活性,BDNF可防止运动神经元的自然死亡,并对损伤的新生大鼠面部运动神经元有保护作用,当神经切断后BDNF、NT-3逆行运输刊运动神经元急剧增加。外源性BDNF能延迟自然发生运动神经元的运动失能，减轻神经肌肉萎缩和运动轴突消失。

基于轴索逆向运输原理，肌肉注射方式广泛应用于病毒介导的神经营养因子的转染中。有研究证明在SOD1小鼠中肌肉注射AAV2-IGF1可延缓病程、延长存活期，而肌肉注射的慢病毒介导VEGF的疗效在同样的动物模型中也得到证明〔29〕。近年也有学者〔15〕发现椎管内注射AAV2-IGF1可起到部分神经保护作用，但尚未证明可延长存活期。

相比效果甚微的利鲁唑，这种方法需要起到多大效果方可应用于临床前实验仍还是个问题〔30〕。因为ALS患者迫切需要更有效的治疗，所以治疗的发展存在很大的市场机遇，尽管如此，大规模地将动物模型从啮齿类向大动物转变仍成为脊髓基因治疗的一大障碍。目前MoNuDin仍为ALS患者基因治疗临床前试验阶段的唯一方式。

5.3抗凋亡蛋白 凋亡是ALS发病机制的一个因素，所以在阻止神经元细胞死亡的研究中抗凋亡亦倍受关注。已有研究证明在体外和SOD1小鼠转染Bcl-xl和Bcl-2这类具抗凋亡作用的基因，对运动神经元细胞的保护作用〔31〕。然而尽管这一结论在一些试验中得以证实但并不能代表其在基因治疗中的进展，仍待长期的深入研究。

5.4基因沉默 基因沉默是指生物体中特定基因由于种种原因不表达或者是表达减少的现象。外源基因进入细胞核后根据其作用机制和水平不同可分为三种：位置效应、转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默。

多数ALS 是由编码SOD1基因显性突变引起的，理论上可以通过基因沉默的方法治疗。RNA 干扰(RNAi) 技术是一种转录后基因沉默方法，可以下调蛋白的表达。在体外培养的细胞中 RNAi 能发挥很好的作用。将稳定的小干扰RNA(siRNA) 注入脑脊液中仍能敲除50% 的靶mRNA。表达了基因沉默siRNA的病毒载体已被用于治疗ALS 动物模型，但并未延长生存期。

有研究发现当抑制小胶质细胞中突变基因的表达时，可显著降低发病后疾病进展速度。虽然目前已有大量研究为成功选择SOD1等位突变的基因沉默提供切实证据，但在选择性敲除星形胶质细胞、运动神经元细胞或是肌细胞中的SOD1突变基因后,仍无法说明ALS的发病机制或分辨不同细胞在病因学的作用。此外，病毒介导的SOD1基因沉默虽然可延长SOD1小鼠的寿命〔32，33〕，但全身注射并不能证明可防止病情恶化〔34〕。近年来对新生小鼠肌肉注射AAV6、shRNAs、SOD1也未能阻止病情发展〔34〕。尽管如此，Isis制药公司已对一种以反义寡核苷酸为基础可抑制SOD1产生的药物-ISIS-SOD1Rx(临床试验标识符NCT01041222)，进行第一阶段的研究以评估安全性。

6 内源性基因治疗

目前外源性基因治疗无论从靶向、途径和方法都未获得满意的疗效，且具有严重的副作用和安全性风险。多数研究结果表明许多外源性基因治疗是没有可行性的。近来动物研究〔35～38〕发现成年哺乳动物脑和脊髓存在神经前体细胞，在ALS等病理调节下，可以活化、增生和定向迁移到疾病受累解剖区，发挥神经修复功能，但其修复能力有限，不能有效地改善神经功能缺损。但这些研究结果为启动内源性神经前体细胞的基因治疗带来了新的希望。如果能找到调控内源性神经前体细胞活化、增生和定向迁移基因治疗方法或途径，必将为治疗或延缓ALS带来新的希望，也克服了外源性基因治疗的许多缺陷。

综上，基因治疗是目前为止最有前景的靶向治疗之一，它能从根本上治愈一些现有的常规疗法所不能治愈的疾病，尤其是某些遗传性疾病，同时其临床应用的伦理学和安全性仍存在争议。对于ALS在现阶段可行的基因治疗方法仅仅局限于保护运动神经元细胞或延缓其变性。

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