体外血液实验创新:用系统模式研究红细胞多种调节功能的进展①

2014-01-27查占山钱宝华第二军医大学长海医院输血科血液免疫研究室上海200433

中国免疫学杂志 2014年5期

郭峰查占山钱宝华（第二军医大学长海医院输血科血液免疫研究室，上海 200433）

郭峰查占山钱宝华（第二军医大学长海医院输血科血液免疫研究室，上海 200433）

系统血液生物学有关理论认为血液系统是由分系统和子系统组成。各分系统和子系统生物功能有不同分功，但它们之间还有协作调控关系。红细胞血红蛋白参与氧和CO2呼吸功能调控，红细胞膜有多种受体，如补体受体、趋化因子受体参与补体活化，细胞因子浓度调控，红细胞胰岛素受体参与胰岛素和血糖浓度调控［1-7］。当异抗原（如艾滋病毒）进入血液后，首先激活补体系统，艾滋病毒颗粒黏附上补体C3b，被红细胞CD35分子作用后，降解为C3d和C3dg，将这种艾滋病毒交给B淋巴细胞CR2分子处理，最终通过有关机制递交给CD4阳性淋巴细胞而发病。有关研究还发现红细胞可释放NK细胞增强因子，调控NK细胞活性。红细胞血红蛋白参与抗淋巴细胞代谢中氧化作用，使CD4/CD8比值上调。红细胞数量巨大，膜受体种类众多，红细胞参与血液免疫反应和内分泌及生化反应等系统血液生物学功能调控机制复杂。淋巴细胞可分泌抗体和各种白细胞因子参与抗感染和抗肿瘤免疫反应，淋巴细胞膜有多种受体如激素受体参与内分泌功能调控等。血小板可释放多种凝血因子调控凝血过程，血小板模有补体受体参与补体活化调节，血小板模有CD55、CD59分子参与T淋巴细胞活性调节［4］。所有血细胞都参与抗感染和抗肿瘤免疫反应，血液系统对外来致病原的反应是一种系统血液免疫反应［1-7］。这需要用系统血液生物学的理论和系统模式实验方法学去研究，才会有新发现和理论创新。这方面研究工作有很大进展，现将有关研究进展综述如下。

1 体外血液系统模式仿真实验体系形成的基础

机体免疫系统不是单一机制，而是通过众多基因，蛋白质互相作用的复杂机制来调控免疫反应对抗感染和疾病的。现代系统免疫学首先要建立系统模式，根据研究目的不同，可在细胞水平，器官水平和机体整体水平构建系统模式仿真。有的学者着力于在体外细胞培养体系建立哺乳动物适应性免疫系统的动态仿真系统模式。我们在体外红细胞免疫黏附功能实验研究中发现枸橼酸抗凝新鲜血是一种动态的和活的血细胞悬液，是一种保持内在互动网络信息的血液生命系统［1，7］，具有 4个特性:整体性、有序性、动态性和目的性，在37℃温育30 min或1 h后，可称其为快速血液培养系统。根据研究目的不同，测定相应的指标，设定相应的公式，进行统计，可设计成不同研究内容的血液系统生物学的体外系统模式仿真实验体系，简称为系统模式。这是一种体外血液实验创新的系统生物学研究方法［1］。

2 体外血液系统模式仿真实验体系种类与应用的发展

血液系统模式仿真实验体系向多样化方向发展，应用范围在不断扩大。

2.1 抗原激活系统血液固有免疫反应系统模式仿真实验种类与应用［1］

2.1.1 抗原（如S180）激活各种血细胞黏附活性变化的系统模式仿真实验［1］一定量的癌细胞悬液加到一定量抗凝新鲜全血试管中，混匀后放37℃温浴30min后，将反应物按常规程序涂片染色。在显微镜下发现红细胞，白细胞及血小板都可黏附癌细胞形成花环。计数100个癌细胞，黏附3个或以上血细胞为一朵花环。黏附红细胞的为红细胞花环，黏附白细胞和血小板的计数为其他血细胞花环。具体方法可参阅文献［1］。统计结果:红细胞花环率平均值为26.5%，其他血细胞花环率平均值为0.9%。两组花环率相比差异显著。这说明红细胞免疫黏附癌细胞的能力显著高于白细胞和血小板。血液中存在补体固有免疫子系统、红细胞固有免疫子系统、粒细胞固有免疫子系统、淋巴细胞固有免疫及适应免疫子系统。这些子系统都参与对致病原的免疫黏附过程。但补体固有免疫子系统和红细胞固有免疫子系统起主导作用。血液系统对外来抗原（病毒、细菌、癌细胞）的识别、黏附、激活系统血液固有免疫和适应免疫反应的过程中，红细胞在免疫黏附外来抗原（如癌细胞S180）中起主干道作用。红细胞在免疫黏附致病原后对它进行改变后，它将致病原递交给白细胞（包括粒细胞和淋巴细胞）固有免疫及适应免疫子系统，进一步激活白细胞免疫反应，我们的实验证明是红细胞CD35分子对外来抗原上补体C3b分子起黏附作用［1］。

2.1.2 抗原激活各种血细胞膜受体活性变化的系统模式仿真实验［1］实验组:一定量抗原（如S180癌细胞）悬液加到抗凝新鲜全血中，对照组:一定量生理盐水（与癌细胞悬液同体积）加到抗凝新鲜全血。两组分别混匀后放37℃，60 min后，将各自反应物按常规程序处理后，测定各种血细胞CD35分子量的变化，白细胞CXCR4分子量的变化。发现实验组红细胞CD35分子量平均值28.65%，明显低于对照组红细胞CD35分子量平均值（40.21%）。说明癌细胞黏附到红细胞CD35分子上，使测定量明显下降。研究还发现实验组白细胞CD35分子平均值（粒细胞860.4%，淋巴细胞239.53%）显著高于对照组白细胞 CD35分子平均值（粒细胞603.63%，淋巴细胞154.66%）。还发现实验组白细胞 CXCR4分子平均值（粒细胞64.18%，淋巴细胞40.16%）显著高于对照组白细胞CXCR4分子平均值（粒细胞40.62%，淋巴细胞34.40%）。这些测定结果说明在补体系统对致病原处理后，免疫黏附到红细胞CD35分子，红细胞CD35等有关免疫分子处理后将有关致病原信息传递给各种白细胞，进一步激活白细胞上的CD35分子，CXCR4分子及其他有关免疫分子，引发白细胞进一步的固有免疫和适应性免疫反应。这为补体、红细胞、白细胞免疫反应为主干道的系统血液固有免疫反应和适应性免疫反应的系统血液生物学理论创新打下了实验基础，也为免疫调节药（包括疫苗）实验性治疗研究提供了血液系统模式体外实验方法。我们认为对艾滋病病毒的免疫调节药实验治疗研究也可利用这血液系统模式进行体外实验性治疗研究。有关系统血液固有免疫学和系统血液生物学理论，还可查阅有关文献［1-8］。

2.2 不加抗原激活系统血液固有免疫反应的体外血液系统模式仿真实验体系的发展与应用［8-18］我们用系统模式研究原发性肝癌的红细胞对细胞因子、血糖、血CO2等多种调节功能的变化，发现肝癌患者红细胞对细胞因子（如IL-8）浓度、血糖浓度、血CO2浓度调控能力都明显下降。这种血液系统模式分两组:全血细胞培养组:0.2 ml全血细胞悬液加0.3 ml自身富含血小板血浆和0.2 ml生理盐水，白细胞培养组:0.2 ml白细胞悬液加0.3 ml富含血小板自身新鲜血浆和0.2 m l生理盐水。各自混匀，37℃温育60 min后，将反应物离心分离，各组反应液分别测定IL-8含量或血糖含量或血CO2含量，设公式，求出各自调控率。调控率=（全血细胞培养组测定值如IL-8值或血糖值或血CO2值－白细胞培养组测定值如IL-8值或血糖值或血CO2值）/白细胞培养组测定值如IL-8值或血糖值或血CO2值。

2.2.1 肝癌患者红细胞对细胞因子浓度的调控能力变化的系统模式仿真实验肝癌患者血液实验设计，分全血细胞培养组和白细胞培养组;正常人血液实验分全血细胞培养组和白细胞培养组。实验后测定四组各自IL-8浓度，肝癌患者全血细胞培养组和白细胞培养组 IL-8平均值分别是 350.76和424.97，正常人全血细胞培养组和白细胞培养组IL-8平均值分别是4.28和14.49。求出正常人和肝癌患者各自红细胞对IL-8吸附率，发现正常人红细胞对IL-8吸附率（平均值0.62）明显高于肝癌红细胞对IL-8吸附率（平均值0.17），这说明肝癌患者红细胞对细胞因子浓度调控能力明显下降。肝癌患者血IL-8含量明显升高，可出现细胞因子IL-8风暴，与红细胞趋化因子受体功能缺陷有关，具体研究方法可查阅有关论文［9-13］。

2.2.2 肝癌患者红细胞对血糖浓度的调控能力变化的系统模式仿真实验。肝癌患者血液实验设计为全血细胞培养组和白细胞培养组;正常人血液实验分为全血细胞培养组和白细胞培养组。实验后测定四组各自血糖浓度，肝癌患者全血细胞培养组和白细胞培养组血糖平均值分别是40.44和46.64。正常人全血细胞培养组和白细胞培养组血糖平均值分别是41.20和49.17。求出正常人和肝癌患者各自红细胞对血糖调控率分别是0.161 7和0.133 6，t=2.931 7，P＜0.05，差异显著。肝癌患者红细胞对血糖调控率明显下降。肝癌患者红细胞胰岛素受体功能缺陷，血糖利用能力下降。原发性肝癌患者肝脏合成糖原功能受损，糖代谢障碍，血糖浓度下降。癌细胞增殖需要消费大量葡萄糖，癌细胞分泌胰岛素，都使血糖含量明显下降。所以在实验中发现肝癌患者血浆中血糖含量明显低于正常人血浆中血糖含量。原发性肝癌患者肝参与造血功能受损，通常都伴有贫血，红细胞膜各种受体功能受损，包括红细胞胰岛素受体功能受损，表现对胰岛素有抗性，所以在实验中出现肝癌患者红细胞对血糖吸附率明显低于正常人红细胞对血糖吸附率。肝癌患者不仅红细胞免疫调节功能下降，而且红细胞胰岛素受体功能等其他生物学调节功能下降。具体研究方法可查阅有关论文［11-13］。

2.2.3 肝癌患者红细胞对血CO2浓度的调控能力变化的系统模式仿真实验肝癌患者血液实验设计，分全血细胞培养组和白细胞培养组。正常人血液实验分全血细胞培养组和白细胞培养组。实验后测定四组各自血CO2浓度，肝癌患者全血细胞培养组和白细胞培养组血CO2平均值分别是13.09和13.63，正常人全血细胞培养组和白细胞培养组血CO2平均值分别是11.46和13.76。求出正常人和肝癌患者各自红细胞对血CO2调控率分别是0.16和0.04，t=23.19，P＜0.01，肝癌患者红细胞对血CO2调控率明显下降。肝癌患者血CO2含量明显上升，与红细胞血红蛋白功能缺陷有关。肝癌患者不仅红细胞免疫调节功能下降，红细胞胰岛素受体生物学调节功能下降。而且肝癌患者贫血，血红蛋白功能受损，带走CO2能力下降，表现为红细胞对血CO2调控率明显低下。肝癌患者贫血引发红细胞的系统血液生物学调节功能全面处于紊乱与不平衡。我们研究说明新鲜血快速培养系统可设计为系统血液生物学（包括系统血液免疫学）体外实验体系，用于红细胞各种系统生物学调节功能研究是可行的，不仅可用于红细胞各种天然免疫调节功能研究，而且也可用于激素，血CO2调控等红细胞的其他系统生物学调节功能研究。我们还认为可设计为白细胞，血小板各种系统血液生物学调节功能研究也是可行的［7-19］。

3 展望与小结

枸橼酸抗凝新鲜血是一种动态的和活的血细胞悬液，而枸橼酸抗凝新鲜血细胞快速培养系统可设计为红细胞的各种血液生物学（包括免疫和生化等）调控系统模式仿真实验体系，这是一种系统生物学研究方法。利用系统模式研究可发现血浆、红细胞、血小板、白细胞之间动态网络关系。这种发现在系统免疫学和系统血液生物学研究中具有重要理论和应用价值。进一步优化各种免疫和生化指标，合理设计仿真血液系统模式实验体系，能形成具有我国特色的一种系统生物学研究方法，为我国医药（包括中医药）等相关基础理论创新研究服务［7-19］。

［1］ Feng Guo.A new recognition:systems blood rapid innate immune response//Schmidt RD:2nd European congress of Immunology［M］.Berlin，Germany.Medimond International proceedings，2009:369-372.

［2］ Hirano T.Cellular pharmacodynamics of immunosuppressive drugs for individualized medicine ［J］.Int Immuno pharmacology，2006，7（1）:3-22.

［3］ Heribert S，Monlia P，Christoph G，et al.Complement-opsonized HIV:the free ride on its way to infection ［J］.Mol Immunol，2005，42:153-160.

［4］ LIN.Pltelet-lymphocyte cross-talk ［J］.J Leukoc Biol，2008，83（157）:1069-1078.

［5］ Arosa FA，Pereiva GF，Fonseca AM.Red blood cells asmodulators of T cell growth and survival［J］.Curr Pharn Des，2004，10（2）:191-201.

［6］ Tournamille G，lancher A，Le Van Kim G，et al.Sequence，evoluting and ligand binding properties ofmammalian duffy antigen/receptor for chemokines［J］.Immunogenetics，2004，55（10）:682-694.

［7］ Guo F，Zeng RL，Sun YH，et al.Enhancement of red cells adhering to tumor cells by cordyceps sinesis in vitro［J］.Clini Immunol，1999，90（3）:444-445.

［8］顾嘉琍，张友尚，高光，等.不同年龄红细胞（人）的增溶胰岛素受体和胰岛素结合以及依赖于胰岛素的磷酸化反应［J］中国生物化学与分子生物学报，1986，V2（3）:13-20.

［9］秦诚，蔡小勇.补体调节蛋白CD46，CD55及CD59在肿瘤免疫治疗中的研究进展［J］.癌症，2006，25（11）:1450-1452.

［10］郭峰.现代系统免疫学的形成与发展［J］.中国免疫学杂志，2010，26（1）:88-91.

［11］郭峰.新鲜血快速培养系统免疫学实验研究［J］.临床医学工程杂志，2011，18（1）:1-3.

［12］郭峰，钱宝华，张乐之，等.红细胞调控CD4/CD8的血细胞快速培养实验研究［J］.临床医学工程杂志，2011，18（1）:10-12.

［13］郭峰，钱宝华，张乐之，等.红细胞调控IL-8/IL-12的血细胞快速培养实验研究［J］.临床医学工程杂志，2011，18（1）:7-9.

［14］郭峰.临床实用的新思路和方法:体外血液生命系统药物治疗个体化试验［J］.临床医学工程杂志，2011，18（1）:4-6.

［15］郭峰.金笔奖榜首有感［J］.中华医学杂志，2005，85（47）:3382-3382.

［16］郭峰.浅谈开展中医药现代系统免疫学研究的重要性［J］.深圳中西医结合杂志，2010，20（1）:8-10.

［17］ Charlotte Schubert.Systems immunology:Complexity captured［J］.Nature，2011，473:113-114.

［18］郭峰.崭新的系统血液固有免疫学研究［J］.中国医药生物技术，2010，5（1）:3-14.