二维电泳和质谱技术在大肠癌与正常肠组织相关差异表达蛋白中的应用

2014-01-27佟雪梅

中国老年学杂志 2014年6期

佟雪梅

(北京威泰科生物技术有限公司研发部，北京 100070)

大肠癌(CRC)是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率随年龄而增长〔1，2〕。早期发现、早期诊断、早期开展规范化的手术治疗是提高CRC疗效的关键〔3〕。近年来蛋白质组学被逐渐应用于临床研究等领域，其研究结果更直接地用于疾病的预防、诊断和治疗,其中二维电泳和质谱技术应用最广泛〔4，5〕。本文通过研究二维电泳和质谱技术在CRC与正常肠组织相关差异表达蛋白,筛选出CRC的早期诊断标志物,从而为CRC的早期诊断和治疗提供科学依据。

1 资料和方法

1.1一般资料选择某院确诊为CRC的15例患者，其中男8例，女7例，年龄30～62〔平均(36.20±7.09)〕岁，分别取其手术切除样本15例为CRC组，取距肿块15 cm以上的大肠组织15例为对照组，标本以低温生理盐水冲洗干净，除去污渍和血液，置于液氮冷存备用。所有病人术前均未行化疗、放疗和其他生物治疗。

1.2方法

1.2.1组织标本蛋白质抽提〔6〕取50 mg组织标本在液氮下充分研磨至粉末状，加入裂解液：6.5 mol/L urea，2%NP，2 mol/L硫脲，1%聚乙二醇辛基苯基醚，100 mol/L二硫苏糖醇,5 mmol/L苯甲基磺酰氟，4%乙醇胺丙基二甲氨基丙磺酸盐(CHAPS)，40 mmol/L三羟甲基氨基甲烷，0.5 mmol/L乙二胺四乙酸，2% pharmalyte，0.25 mg/ml核糖核酸酶A 1 mg/ml，胰脱氧核糖核酸酶400 μl，充分混匀，然后置于37℃孵育1 h，取出后再混匀，4℃ 15 000 r/min离心3 min，所得的上清液即为组织总蛋白。最后通过二喹啉甲酸(BCA)法测定样本的蛋白质浓度。

1.2.2组织标本蛋白质浓度测定用2.0 mg/ml的牛血清白蛋白配制出浓度梯度为0.125、0.25、0.5、1、1.5 mg/ml的标准蛋白，在波长570 nm下用酶标仪检测各浓度的光密度值。以标准蛋白浓度为横坐标，相应的光密度值为纵坐标绘制标准曲线，得到直线回归方程，最后将待测蛋白样本的光密度值带入此方程算出所测蛋白质的浓度。

1.2.3二维电泳〔7〕参照《双向电泳原理与方法》：将蛋白样品(400 μg)与水化液(300 μl)充分混合振荡后上样，加入pH梯度干胶系(IPG)持胶槽(避免产生气泡)，再将IPG胶条去掉保护膜后，以胶面向下的方式将IPG胶条放入电泳槽进行IEF电泳，加上覆盖液，置于IPGphor等电聚胶仪上，水化和聚焦在20℃自动进行，总电压时间积为52 420 Vh，其中30 V低电压水化14 h，然后经过500 Vh，1 000 Vh，3 000 V 0.5 h，5 000 V 0.5 h，6 000 V 0.5 h，7 000 V 0.5 h，8 000 V 5 h，最大电流55 μA。电泳结束后取出胶条、冲洗及平衡。将胶条放于十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)胶筒上进行第二向电泳。根据正负极标志连接好电泳槽和电源，打开电源开关，先以30 mA恒流慢速电泳20 min(15 mA，根)，20 min后以60 mA恒流电泳，溴酚蓝标志线接近凝胶底部时电泳结束。

1.2.4凝胶图案分析〔8〕首先用Labscan扫描软件和Imagescaner扫描仪对凝胶进行扫描得到相应图像，然后利用PD-quest7.3软件分别对结肠癌和正常肠组织的双相电泳图像进行校正点检测、背景消减与点匹配、1D与2D棱正，进而建立平均凝胶，量化得到的蛋白斑点的信息。

1.2.5质谱分析〔9〕选取二维电泳图像分析得到的差异蛋白质点，在凝胶上取得这些点，依次进行脱色、烷基化、冲洗、脱水至完全干燥。然后依次进行酶解、萃取、离心和脱盐。最后将样品与基质液混合充分后取其混合液点样于点样板上，待样本自然风干进行质谱分析〔10〕。质谱分析步骤：将点样板置于质谱仪中进行分析，得到指纹图案，利用Profound软件在蛋白质序列数据库中搜索该指纹数据，确定各点所属蛋白。

1.3检测试剂和仪器固相IPG pH 3～10、裂解液、BCA、牛血清白蛋白、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、二硫苏糖醇(DTT)、铁氰化钾、碘乙酰胺、三氟己酸、胰蛋白酶等(Sigma提供)。离心机、酶标仪、IPGphor等电聚胶仪、SDS-PAGE胶筒、实验常用仪器等(Sigma提供)。

1.4统计学方法采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结果

2.1二维电泳结果分析 CRC样本和对照组样本均采用二维电泳方法获得蛋白质双向电泳图谱后，另外在相同条件下对同一蛋白样品进行3次双向电泳后发现：蛋白斑点主要聚集在pH 4～8、分子量20～100 kD范围；CRC组的平均蛋白质点数为974±28，而对照组为632±19，两组比较具有统计学差异(P<0.05)；两组3块胶中的蛋白质点在其位置上均有较好的重复性，两两间的匹配度最高可达到90.0%； IEF方向上，大肠癌组的偏差平均值分别为(0.713±0.204) mm，对照组为(0.582±0.193) mm，两组在IEF方向上的偏差具有统计学差异(P<0.05)； SDS-PAGE方向，大肠癌组偏差平均值为(0.977±0.372) mm，对照组为(1.170±0.412) mm，两组在SDS-PAGE方向的偏差具有统计学差异(P<0.05)。差异蛋白质点的确定标准为：蛋白质点的表达量与所匹配蛋白质点的表达量总和比值>3，且同组3块胶图谱中均出现相同变化的蛋白点。研究发现，两组的差异蛋白质点数为75.20±18.76。

2.2质谱分析结果在大肠癌组和对照组的二维电泳图谱中，选取其中大肠癌组表达高于对照组的蛋白质点36个进行质谱分析。以Mowse分为基础概率评价数据库搜寻结果的质量，分值大小表示鉴定蛋白随机匹配的可能性，匹配分值大于63说明具有显著性意义。本研究鉴定的36个点中，质谱分析鉴定CRC异常表达蛋白类型有ACTB protein、annexin Ⅱ、annexinⅣ、APOALPROTEIN、 calreticulin precursor、 fatty acid-binding protein、hepatic、Actin bata、11s regulator, chain B、HSP27、pregnancy-specific glcoprotein、Chaperonin containing TCP 1、Transgelin、glutathione s-transferase、tubulin beta chain、triosephosphate isom erase、serum album in, chain A。

3 讨论

CRC在遗传因素和环境的综合作用下，经历多步骤、多基因及多阶段复杂的生物学过程。结直肠上皮细胞增生-腺瘤-非典型增生-癌-转移癌为CRC发生发展的模式。在其发病的不同时期，肿瘤细胞由于基因组改变进而产生一些与肿瘤相关或者一些肿瘤特异的小分子蛋白质，另外还可能分泌一些细胞因子或相关抗体，这些物质释放到血液成为CRC的相关血清肿瘤标志物〔11〕。CRC目前在我国恶性肿瘤中列第5位，其发病率和死亡率呈逐年增高的趋势，尽管近年诊治水平有明显提高，但病死率仍居高不下，其主要原因就是CRC很难被早期发现，大部分患者到中晚期才被确诊，从而错过了手术的最佳时机〔12〕。因此，研究CRC的发生机制、发现CRC特异性标志物及研究其相应的检测技术已然成为目前CRC防治的关键问题。

在肿瘤生物标志物筛选检测技术方面，高通量生物技术应用较为广泛, 包括基因芯片, 蛋白质组学技术/蛋白质芯片等〔13〕。蛋白质组学以细胞内全部蛋白的存在及其活动方式为研究对象，研究的内容是识别及鉴定一种细胞或组织的蛋白质表达模式〔13〕。其中二维电泳，又称为二维APGE电泳，结合了等电聚焦技术(根据蛋白质等电点进行分离)以及SDS-PAGE电泳技术(根据蛋白质大小进行分离)，是表达蛋白质组学研究的有效手段之一，是目前唯一能将上万个蛋白质点同时分离与展示的技术〔14〕。质谱法是利用电磁学原理，对荷电分子或亚分子裂片依其质量和电荷的比值(质荷比，m/z)进行分离和分析的方法，在肿瘤标志物的检测上应用广泛〔12〕。采用蛋白质组学技术筛选CRC发生发展相关蛋白是可行、有效的。

4 参考文献

1叶任高.内科学〔M〕.第5版.北京:人民卫生出版社,2000:1231-4.

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3吕仙梅,郑坚,朱莹杰,等.中医药联合化疗对大肠癌Ⅱ、Ⅲ期患者生存期的影响〔J〕.中国中西医结合杂志,2012;32(9):1166-70.

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5李峰,关勇军,陈主初,等.蛋白质组学及其在肿瘤研究中的应用〔J〕.生物化学与生物物理进展,2001;28(2):164-7.

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7王振玲,王栋,朱化彬,等.二维电泳分离牛精子蛋白技术〔J〕.中国生物工程杂志,2006;26(9):61-6.

8王浩飞,向祖琼,王益鑫,等.人精子膜蛋白的二维电泳实验研究〔J〕.中华男科学杂志,2003;9(7):504-6.

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10邢加迪,张连海,李晶晶,等.飞行时间质谱技术在结直肠癌K-ras基因突变检测中的应用〔J〕.中华胃肠外科杂志,2013;16(1):80-3.

11王竞.Artemin和MMP-9在大肠癌中表达的关系〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(8):1769-70.