猫传染性鼻-结膜炎实验室诊断方法研究进展

王一鸣，应 瑛，刘秋艳，陈小庆，马剑钢，赵艳丽，胡桂学

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春130118）

猫传染性鼻-结膜炎是由杯状病毒科（Caliciviridae）疱疹病毒属（Vesivirus）的猫杯状病毒（Feline calicivirus，FCV）引起的猫及猫科动物重要呼吸道传染病，其主要症状表现为结膜炎、急性口腔溃疡、上呼吸道炎症和慢性胃炎等。自1957年Fastier首次分离鉴定FCV以来，在欧洲、美洲、亚洲均有发现，目前已呈世界性分布[1-2]。猫被认为是该病毒的自然宿主。猫杯状病毒的显著生物学特征是仅有一个血清型,同时具有丰富的抗原多样性，遗传变异性也很强，这成为猫杯状病毒及时诊断和有效防制的一大难题。对病毒进行分离鉴定是确切诊断该病毒的惯用方法，对病毒抗体的检测在日常研究中也较为常见。临床诊断法虽然简单易行，但由于症状变化较大,易与其他呼吸道疾病混淆，引起误诊。因此,猫杯状病毒病主要依靠病原学、血清学和分子生物学等实验室方法进行确切诊断。

1 病原学诊断方法

1.1 病毒的分离鉴定 病毒的分离鉴定作为大多数病毒的常规诊断方法和经典方法，已被各国实验室所采用，同时也是世界动物卫生组织（WHO）推荐的方法[3]。尽管不断有检测猫杯状病毒的新方法出现，但是病毒的分离鉴定作为检测病原的“黄金标准”仍将一直沿用，许多新方法的建立均需用其验证。将处理后的病料接种处于对数期的F81细胞后，在适宜条件下培养，每天观察细胞病变。FCV在F81细胞上的病变特征是细胞圆缩、聚集同鱼籽样病变，最后完全脱落、悬浮。若未出现细胞病变，在接种后3～5 d进行细胞传代。连续传5～6代后，若病料中有病毒存在，则再次接种细胞后，可出现细胞病变效应。范泉水等[4]应用F81细胞带毒传代的方法，先后从处理的样品中分离到了2株病毒。Abd-Eldaim等[5]认为猫杯状病毒最主要的诊断方法是依靠接种培养好的细胞来分离病毒，并使用CRFK细胞对2株猫杯状病毒进行了分离鉴定。Poulet等[6]将采集到的拭子样本稀释4倍后接种到CRFK细胞上，以此来分离病毒。病毒的分离鉴定法具有操作相对简单、费用低、可排除动物的隐性感染等优点，但其相对耗时，一般需要多天甚至2周以上才能报告结果[7]。

1.2 电镜检测技术 由于猫杯状病毒在形态上有比较明显的特征，因而可用电镜技术或免疫电镜技术进行鉴定。刘晔等[8]将获得的HFC-2006培养物接种长成单层的F81细胞，采用负染电镜技术，观察到典型的杯状病毒粒子。艾纯旭等[9]通过负染电镜观察纯化后的FCV，发现镜下较多呈二十面体对称、直径35～39 nm、没有囊膜的病毒粒子，杂蛋白含量较少。电镜检测技术快速、准确，但检测结果对样品制备、病料采集部位及时间有一定的要求，且该方法不能用来区分异源毒株。免疫电镜技术可用来分析病毒粒子的成分和含量及所包装病毒粒子的细胞成分[10]。

2 血清学诊断方法

目前，血清学诊断方法主要有病毒中和试验（NT）、免疫荧光试验（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，这些方法已广泛应用于猫传染性鼻-结膜炎的诊断、血清学调查、免疫学研究和疫苗免疫原性的评价。

2.1 病毒中和试验 病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力，谓之中和试验[11]。通过固定病毒稀释血清或固定血清稀释病毒可以检测抗FCV血清中和抗体效价，与阳性血清对比即可判定是否发生了感染。Masubuchi等[12]采用微板法将FC-7、FC-28、FC-64三种已知疫苗毒血清与58株FCV自然分离株进行中和，证实了自然毒与疫苗毒的抗原相关性。范泉水等[4]采用固定病毒稀释血清法，在微量细胞培养板中，用维持液将兔抗TFCV9710-4株毒和兔抗FCV疫苗标准毒株（F9株）的灭活血清作8～2048倍的稀释，分别与等量的含100个TCID50的TFCV9710-4和疫苗标准毒株混合，Reed-Muench法计算各血清对2个毒株50%中和终点稀释度，以此对2个毒株的抗原性进行分析。由于猫群中存在自然感染和接种疫苗，血清阳性率普遍偏高。因此，中和抗体的存在并不常用于该病的诊断，多用于评价疫苗的免疫效果[7]。

2.2 免疫荧光试验 将已知抗原或抗体标记上荧光色素使之成为荧光标记物，再用该荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗体或抗原，即可在荧光显微镜下观察特异性荧光反应。Fulvio等[13]认为，在猫杯状病毒的慢性感染及再次感染中，用免疫荧光法进行诊断的敏感性要低于病毒分离法。但在鉴定细胞培养分离到的病毒时，采用免疫荧光法则较为可靠。此外，他们还采用间接免疫荧光试验对87份黏膜拭子中（眼结膜和咽喉部）的猫杯状病毒分离株进行鉴定，在加入异硫氰酸荧光素结合的兔抗猫IgG抗体后使反应可见。蒋虹等[14]通过摸索猫杯状病毒的培养条件，制备兔抗猫IgG抗体，建立免疫酶染色法（IEA）和免疫荧光法（IFA）2种检测猫病毒抗体的血清学方法。免疫荧光法具有简单快速、敏感性高、检测费用较低等优点。但是，使用该方法在检测过程中可能会因假阳性产生的非特异性荧光而对结果判定产生一定干扰。

2.3酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验（ELISA），是将已知的可溶性抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，用相应酶标记二抗，通过显色反应来检测抗原或抗体，是经典的血清学检测方法[15]。其简单步骤为采集疑似患病动物血清,首先在酶标反应板包被已知病毒液,加入待检血清,再加入HRP等酶标记的二抗,显色后用酶标仪测定样品OD值。Javier等[16]采用INGENASA、EVL-Eurovet和公司的商品化ELISA试剂盒对西班牙中部托利多山地区内的野猫群的常见猫病原FIV、FeLv、FCov、FCV、FHV、FPV等进行检测，其中采用ELISA方法对FCV的检出率达80%。Yuan等[17]根据IgM的亚型抗体E5和IgG2b的亚型抗体H4两种单克隆抗体对FCV的识别区域不同，将其用来包被微孔板，并制备了2种酶标记二抗，以此建立检测FCV的双抗体夹心酶联免疫检测法，为FCV单克隆抗体的制备及其基本生物学特性的确定提供了新的技术路径。ELISA法具有较高的敏感性,既可以用来检测抗体,又可以检测抗原，适于大量样品的血清学检查,且结果易于分析。

3 分子生物学诊断技术

3.1 核酸探针技术 核酸分子杂交技术是20世纪晚期在生物学领域中发展起来的一项新技术，可以定性和定量检测特异性DNA或RNA。对于不易分离培养的微生物标本，及大量培养增殖后有“危险性”的病毒标本，均可用核酸探针直接检测。该方法灵敏度较高，适合较大量的标本检测[18]。Mohamed等[19]评估、优化并授权了一种使用特异性杂交探针的实时RT-PCR方法用于FCV的检测和定量。随着人们对基因精细结构的深入细致的研究和DNA合成技术的发展，已经能够人工合成寡聚核苷酸片段作为探针来使用[20]。由于DNA探针来源比较丰富，所以可提高探针浓度来缩短杂交时间。

3.2 RT-PCR技术

3.2.1 巢式PCR 巢式PCR检测方法是近几年发展起来的一种分子生物学诊断技术，具有特异、敏感、简便、快捷等特点，能在数小时内检出痕量病原[21]。近年来，应用巢式PCR技术诊断猫杯状病毒感染的报道很多。Fulvio等[13]用巢式PCR方法对47份结膜拭子和40份咽拭子进行检测，并用巢式PCR与RTPCR方法分别对10倍稀释的纯化F9株进行检测，然后与病毒分离法进行了比较。结果用一步法RTPCR检出了5份阳性结膜拭子和12份阳性咽拭子，巢式PCR检出了18份阳性结膜拭子和23份阳性咽拭子结果。而采用病毒分离法仅从5份结膜拭子和13份咽拭子中分离到病毒。该作者还证实，FCV在CRFK细胞的感染性滴度为10-8，巢式PCR的检测限为10-11。由此可见，巢式PCR检测FCV的敏感性高于一步法RT-PCR和病毒分离等方法。

3.2.2 实时荧光定量PCR 将荧光素标记的探针与引物一起在荧光PCR仪中反应,整个反应可以进行实时监测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。Chris等[22]采用SYBR green I建立了实时荧光定量PCR方法，并用此法对FCV分离株进行了检测，通过对熔解曲线和熔解温度的分析，可以区分不同FCV分离株。其敏感度高，可精确定量较宽线性范围内的病毒模板浓度。Mohamed等[19]报道了以基因组5′区前20个核苷酸作为高度保守的引物和探针，建立了检测FCV的Taq Man实时荧光定量PCR法，并用此法和病毒分离法同时对122个样本进行了检测。结果证实，该法的灵敏度与特异性与病毒分离法相当，但检测过程用时更短。姜雪等[23]根据GenBank中编码FCV衣壳蛋白ORF2的保守序列，设计并合成了1对引物及相应的Taq Man探针，建立了快速检测FCV的荧光定量PCR方法。在对临床24份疑似病料（其中阳性3份、阴性21份）的检测中，该方法检测cDNA的线性范围为2.26×1011～2.26×101拷贝/μL；可检测出样品中的FCV，其他相关病毒检测为阴性，与病毒分离结果相符。实时荧光定量PCR法与常规PCR相比具有特异性更强、自动化程度更高等特点，有效解决了PCR污染问题，可用于FCV的精确诊断以及检测所采样品中的病毒含量[3]。

4 结论与展望

猫杯状病毒作为猫科动物的一种重要上呼吸道传染病病原，具有基因变异性强、自然宿主广泛以及同其他猫上呼吸道疾病相似的特点，为该病的诊断和预防带来很大困难。尽管上述诊断技术已成功应用于猫杯状病毒病的诊断，使该病的诊断水平迈上了一个新的台阶。但基于每种诊断方法的局限性，有必要建立一种集几种诊断方法于一体的复合诊断方法，既能够快速诊断又能保证其准确性。国外学者多采用敏感细胞分离培养病毒，再用荧光抗体染色等血清学方法鉴定病毒，达到确诊的目的[5-13]。有专家指出，FCV的正确诊断途径应同时包括对咽拭子和结膜拭子的检测[13]。综上，在该病的实验室诊断中，应根据实际情况并结合已有的实验条件采用2种或2种以上的方法进行诊断。此外，还应考虑每种检测方法的敏感性和特异性。相信随着科学技术的不断发展以及人们对宠物疾病的重视，未来将会涌现出更多针对猫杯状病毒感染更快速、准确的实验室诊断新技术。

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