超微粉碎对黄连解毒散中成分吸收的影响试验

李艳玲，刘永录，于 瑞，张国祖

（1.河南牧业经济学院药物工程系，河南 郑州450011；2.河南康星药业有限公司，河南 中牟451464）

超微粉碎技术是近20年发展起来的一项跨学科、跨行业的高新技术，应用这种技术可将固体物料粉碎成直径小于10μm的粉体。它在中药制药行业的应用虽然起步较晚，但已显示出独特的优势和广阔的应用前景。将它应用于中药制剂的制备，可大幅度地提高药材中有效成分的释放和在体内的吸收[1-2]。到目前为止，关于中药超微粉的药动学报道越来越多，但在兽药领域对于这方面的研究报道还是较少，特别是直接运用到鸡个体本身去研究相关的药动学的更少。

黄连解毒散具有清热泻火解毒之功效,在兽医临床上广泛应用于败血症、脓毒血症、痢疾等各种急性炎症。基于黄连解毒散在禽病防治中应用的广泛性，本试验分别给鸡灌服黄连解毒散超微粉和普通粉后，采用HPLC测定黄连解毒散中有效成分小檗碱和栀子苷的在粪便中的含量，以期验证黄连解毒散经超微粉碎后有效成分在鸡体内的变化规律及其生物利用度，为黄连解毒散超微粉的临床应用提供借鉴和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材 黄连解毒散由黄连、黄柏、黄芩和栀子按规定比例混合而成。黄连解毒散普通粉由粉碎机粉碎，过80目筛。黄连解毒散超微粉由河南康星药业有限公司采用超微粉碎技术制成，过400目筛。

1.1.2 动物 AA肉鸡37日龄。

1.1.3 仪器 Waters液相色谱仪和Waters.2487双波长UV检测器（美国Waters公司）；超微粉碎机（开封市同创超细粉体工程技术开发中心）。

1.1.4 试剂 栀子苷（批号：110749-220714）和小檗碱（批号：110713-200911）标准对照品(由中国药品生物制品检定所提供)，甲醇和乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 样品的收集 150只鸡随机分为甲、乙、丙3组，每组50只。甲组灌胃给80目的黄连解毒散，2 g/只；乙组灌胃给400目的黄连解毒散，2 g/只，丙组灌胃给400目的黄连解毒散，1 g/只，给药2.5 h后开始收集粪便，2.5～3.5 h，3.5～4.5 h、4.5～5.5 h、5.5～6.5 h、6.5～7.5 h、7.5～8.5 h、8.5～9.5 h、9.5～10.5 h时间段收集粪便。60℃以下温度充分干燥，称重，研细，进行含量测定。

1.2.2 小檗碱的测定

1.2.2.1 色谱条件 色谱柱为XBriageTMC18（4.6mm×250mm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水（40∶60），0.1%磷酸水内含0.1%十二烷基磺酸钠，流速1mL·min，柱温30℃，波长346 nm。

1.2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取小檗碱对照品适量，加甲醇制成50μg/mL溶液，即得。

1.2.2.3 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1mL，加甲醇稀释到100mL的容量瓶中，制成0.5μg/mL的标准储备液，精密吸取1、2、5、10、20μL分别进样，按上述色谱条件测定峰面积，以对照品量为横坐标，峰面积为纵坐标,计算回归方程：y=21.973x+28.999，r=0.9999（n=6），说明小檗碱在0.5～25μg/mL呈良好的线性关系。

1.2.2.4 精密度试验 吸取对照品溶液10μL，重复进样5次，测定相应的峰面积，RSD为0.032%，说明精密度良好。

1.2.2.5 重复性试验 称取同一批样品5份，按供试品溶液的制备方法处理后，分别进样10μL，结果RSD为1.72%（n=5）。

1.2.2.6 回收率试验 分别精密称取已知含量的样品5份，精密加入一定量的小檗碱对照品，按超声波提取方法分别制备供试品，在上述色谱条件下进行测定，计算加样回收率，结果平均回收率为97.6%，RSD为0.65%。

1.2.2.7 样品液的制备 称取干燥的鸡粪1 g，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇15mL，超声30min后，滤入25mL量瓶中，甲醇洗涤锥形瓶和滤液一并滤入量瓶中，定容至刻度，用0.22 nm滤膜过滤，即得。

1.2.2.8 样品的测定 吸取样品液10μL进样，按上述色谱条件测定，见图1、图2，计算样品中小檗碱的含量。结果见表1。

图1 小檗碱标准品

图2 小檗碱样品

表1 鸡粪中小檗碱的排出量 （X±SD）

1.2.3 栀子苷的测定

1.2.3.1 色谱条件 色谱柱为大连依利特C18（4.6mm×250mm），流动相为甲醇：水（31∶69），流速为1mL/min，柱温为30℃，波长为238 nm。

1.2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成90μg/mL溶液，即得。

1.2.3.3 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8mL于5个10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度。各进样10μL,按上述色谱条件测定峰面积，以对照品量为横坐标,峰面积为纵坐标,计算回归方程为y=20.648x-4.9657，相关系数r=0.9999．栀子苷在18～180μg/mL呈良好的线性关系。

1.2.3.4 精密度试验 吸取对照品溶液10μL，连续进样5次，测定相应的峰面积，RSD为0.083%，说明精密度良好。

1.2.3.5 重复性试验 精密称取同一批样品5份，按供试品溶液的制备方法处理后，分别进样10 μL，用外标法计算栀子苷含量，其RSD分别为1.87%（n=5），表明该法重现性良好。

1.2.3.6 加样回收试验 分别精密称取已知含量的样品5份，精密加入一定量的栀子苷对照品，按超声波提取方法分别制备供试品，在上述色谱条件下进行测定，计算加样回收率，结果平均回收率为98.1%，RSD为2.68%，表明该方法可行。

1.2.3.7 样品液的制备 称取干燥的鸡粪1 g，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇15mL，超声30min后，滤入25mL量瓶中，甲醇洗涤锥形瓶和滤液一并滤入量瓶中，定容至刻度，用0.22 nm滤膜过滤，即得。

1.2.3.8 样品的测定 吸取样品液10μL进样，按上述色谱条件测定，见图3、图4，计算样品中栀子苷的含量。结果见表2。

图3 栀子苷标准品

图4 栀子苷样品

表2 鸡粪中栀子苷的排出量 （X±SD）

2 结果与分析

2.1 超微粉碎对黄连解毒散中小檗碱吸收的影响 表1是鸡分别灌服过黄连解毒散的普通粉和超微粉后，测得的不同时间段鸡粪中小檗碱的含量。表1结果表明，灌服相同剂量的黄连解毒散，超微粉组和普通粉组相比，鸡粪便中小檗碱的量没有显著差异（P＞0.05）；当超微粉组的剂量是普通粉剂量的1/2时，鸡粪中小檗碱的量也基本减半。说明经过超微粉碎并没有增加小檗碱在鸡体内的吸收。

2.2 超微粉碎对黄连解毒散中栀子苷吸收的影响

表2是鸡分别灌服过黄连解毒散的普通粉和超微粉后，测得的不同时间段鸡粪中栀子苷的含量。表2结果表明，灌服相同剂量的黄连解毒散，超微粉组和普通粉组相比，超微粉组鸡粪中栀子苷的总量明显减少，两组相比有显著差异（P＜0.05），说明经过超微粉碎增加了栀子苷在鸡体内的吸收。

3 讨论

很多相关报道都证明中药经过超微粉碎后，其中的有效成分吸收利用度会大大增加，如对扶正解毒散超微粉在感染IBDV的鸡体内药动学研究结果表明，和普通粉相比，扶正解毒散超微粉在鸡体内的吸收较快,分布也较快。穿心莲经超微粉碎后,可显著提高其有效成分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的生物利用度等[4]。

植物药材经过超微粉碎后，由于细胞破壁，有效成分的溶出理论上应该是增多加快，在动物体内的生物利用度也应该增加。由表1可以看出，小檗碱的排出量甲组和乙组是相当的，甲组是丙组的2倍，说明经过超微粉碎后并没有增加小檗碱在体内的吸收利用度。分析其原因，可能是小檗碱由于溶解度不好，在体内的吸收很差，有文献报道小檗碱在体内的吸收利用度只有2.3%[3]，所以当小檗碱在体内的吸收达到饱和时，即使再增加小檗碱在体内溶出量，也不会被机体所吸收，最后都随粪便排出。由表2可以看出，栀子苷的排出量甲组是乙组1.44倍、是丙组的3.5倍，说明超微粉碎后栀子苷在体内的吸收利用度大大增加，大约能提高44%。有报道称栀子苷由于在体内整个肠道都有吸收，具有广泛的吸收窗，容易吸收[5]，经过超微粉碎后细胞破壁，栀子苷的溶出增加，所以能大幅度增加其生物利用度。

通过本试验说明，超微粉碎并不是适合于所有的中药材，对于在体内吸收利用度好的成分经超微粉碎后，能大幅度增加其生物利用度，而对于溶解度差、吸收不好、在体内容易达到饱和的成分，超微粉碎是否有意义有待于进一步研究。

该试验通过测定鸡粪中黄连解毒散有效成分小檗碱、栀子苷的排出量，进而推测小檗碱、栀子苷在鸡体内的吸收利用情况，和原来的采血测血药浓度的方法相比，简单易行，且避免疼痛使鸡产生应激反应而影响成分的吸收，精确度高，具有较高的推广价值。

[1]关天增，雷敬卫，郑艳丽.浅谈超微粉碎[J].中国中药杂志，2002，27（7）：499-501．

[2]杜军.超微粉碎-提高兽药生物利用度的有效方法[J].中国兽药杂志，2004，38（2）：51-53．

[3]高海鹏，肖飞，马红伟，等.盐酸小檗碱在鸡体内的药动学研究[J].中国兽药杂志，2009，43（3）：31-34.

[4]韩凤梅，蔡文涛，夏启松，等.穿心莲片中脱水穿心莲内酯在大鼠血浆中的药代动力学[J].中华中医药杂志，2005，20（4）：206-209.

[5]杜先华，牛欣，冯前进.栀子苷在大鼠体肠吸收动力学的研究[J].华西药学杂志，2008，23（5）：558-560.