蛋白质组学及其在奶牛乏情研究中的应用前景

许楚楚，夏 成，王朋贤，孙雨航，舒 适，李昌盛

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆163319）

近十多年来，我国奶牛集约化规模化养殖场不断增加，单产水平不断提高，繁殖障碍疾病发生率呈现增高趋势。据统计，我国奶牛繁殖障碍发生率达20%～40%，其中产后乏情奶牛占繁殖障碍的26.68%；美国约有38%奶牛产后60～80 d不表现发情[1]。集约化牛场高产奶牛产后乏情的现象更为普遍，乏情率可高达50%以上。据报道，1头奶牛缩短一个空怀期可节约饲养费600多元人民币，经济效益十分显著。因此，乏情是高产奶牛产后亟待解决的一个重要的繁殖障碍问题[2]。

奶牛乏情是指产后60～90 d未能发情配种的经产母牛[3]。奶牛产后乏情主要分为两种类型：（1）功能性不发情（也称暗发情或隐性发情），即90%有发情周期而无外部表现；（2）真正的不发情（卵巢静止），即无发情表现又无卵巢周期和排卵[4]。目前，卵巢静止所致的乏情已成为高产母牛产后不孕的主要原因。非传染性因素已成为其重要病因，主要涉及营养因素、体况、内分泌、生殖器官等因素。实践中单一因素致病的情况较少，往往是多种病因共同作用或协同作用的结果[5]。这些因素通过神经内分泌系统传递信号到生殖系统，最终导致生殖激素紊乱,引起奶牛乏情。

1 奶牛产后乏情的研究现状

1.1 奶牛产后乏情的原因（1）能量平衡因素：日粮中蛋白、能量、维生素、矿物元素等营养成分的均衡搭配是机体维持生殖机能正常的必要条件。其中日粮能量水平对发情周期、胚胎质量和受胎率的影响较大[6]。奶牛在能量负平衡，体重下降期间，促卵泡素分泌频率降低，活动卵泡直径减少，乏情比率高，配种受胎率低。研究显示，产后发情周期的开始与产后能量负平衡最低点出现的时间密切相关[7]。产后能量负平衡很快回到正平衡的母牛，发情及受胎较快较早，反之较晚。饲料摄入是影响产后能量平衡的一个主要因素。产后能量平衡变化主要与干物质摄入量有关，而与泌乳量关系尚不确定[8]。然而，高产奶牛乏情比率高是一个不争的事实。因此，探讨泌乳量、干物质摄入对产后奶牛代谢和生殖机能的调控作用，对阐明奶牛产后乏情的发生机制是十分必要的；（2）体况因素：它是指其体内所贮备的脂肪量或能量的水平，是奶牛健康、高产和高繁的标志之一。体况评分（Body Condition Score，BCS）是衡量奶牛体组织储存状况及监控奶牛能量平衡的一种数字化评定方法。最常用的是美国5分制体系[9]。研究表明，怀孕后期、产犊及泌乳早期的能量储备会影响产后发情周期和怀孕的成功率。产犊时BCS接近3.5的牛，产后头5周体况分下降不到0.5分的母牛产奶量、健康状况及繁殖力较好[10]。研究显示，胰岛素和胰岛素样生长因子（Insulin-like Growth Factor IGF）；IGF可直接作用于卵巢，同时也能直接作用于子宫和胚胎。胰岛素和IGF可能是影响体况形成的因素。这些体况涉及子宫、胚胎、卵泡的发育和排卵[11]。体况降低较多的牛黄体分泌的孕酮少。低体况分总是与卵巢活性延迟，垂体激素释放不明显，卵泡对促性腺激素的反应低及卵泡活力下降相联系。奶牛产后出现乏情是正常的生理调节，但当它延长到繁殖期时，就会导致繁殖障碍[12]。尽管增加日粮能量可改善能量平衡与繁殖力之间的关系，但其作用方式尚不明了。并且体况不能直接的反映产后乏情奶牛代谢和生殖机能异常的信息，难以为现场早期预防乏情提供更科学的、有效的策略；（3）内分泌异常：在维持代谢与生殖机能之间存在着许多起连接作用的物质，包括内分泌系统复杂的综合作用以及控制新陈代谢和生殖机能的代谢信号和激素等。这些信号分子都属于调节能量和营养物质分配及生殖机能的控制系统。当营养物在体内被识别后许多位点、器官，会产生这些信号分子。为了确保能量调节，蛋白质分配，繁殖过程中的综合作用的精确进行，任何一种信号都很可能会与其他信号存在相互作用。前视觉-下丘脑连续体涉及食物、发情行为、营养感觉的综合作用，可以释放激素。这些激素可以控制促性腺激素和生长激素的分泌，促性腺系统是在繁殖中起关键作用，而生长激素系统在泌乳、脂解作用、组织维持中起关键作用[15]。另外，促性腺激素、生长激素与其他的激素如类胰岛素生长因子（IGF）、胰岛素等相互作用，促进激素和代谢物的释放，这些激素能回流到控制食欲和繁殖的中枢。它们也会直接作用于乳腺和生殖器官。另外，卵泡的敏感性与外周的代谢激素浓度变化是协同的。这些代谢激素包括生长激素、胰岛素、IGF-1和生物碱，可影响体内脂肪酸、氨基酸、葡萄糖等代谢物的变化[16]。相关研究表明，在反刍动物中某些代谢激素能直接地明显地调节卵巢中雌二醇的分泌。卵巢对刺激生殖腺的作用有一定程度的独立性，并能对代谢物做出直接的反应[11]。这些都会受到奶牛产后营养和代谢物质及泌乳量等多种因素的影响，导致内分泌失调，造成奶牛乏情。由于参与奶牛产后发情调控的因子众多、途径复杂，因此明确奶牛发情和乏情之间体内能量代谢和生殖机能的主要差异变化，对阐明奶牛产后乏情的能量代谢调控作用机制具有重要的理论意义。

1.2 奶牛乏情的检测方法 在奶牛养殖中，为增加牛奶产量，使奶牛及时受孕、产犊并提高泌乳是非常重要的，而要达到上述目的，正确高效地预测以及检测奶牛的发情，并适时配种尤为关键。传统的奶牛发情行为检测方法包括：外部观察法，试情法，直肠检查法和B超检查[17]。以上各种方法都具有一个共同点，那就是都需要大量的劳动力来实际操作，并且会影响到奶牛的正常活动，效率低，且要求管理人员技术娴熟，工作量大，劳动强度大，负担较重，且准确度较低，因而时常错过奶牛的发情期而不能及时配种。因此，传统的奶牛发情检测方法愈加不能满足现代化奶牛养殖场的需求，基于微机系统的自动化电子检测技术开始应用到奶牛发情检测。这些技术主要是传感器技术包括角度传感器、计步器、加速度传感器、自动图像处理技术、激光技术、位置控制技术以及磁场感应技术等，结合专家分析平台。数字化检测仪器不仅大大减少了劳动负担，对奶牛的繁殖性能测定比传统方法更精确，大大提高奶牛繁殖效率[18-19]。然而，这些数字化检测系统仅能检测奶牛发情行为和某些生理指标（心跳、脉搏和体温等），甚至孕酮等，能及时发现发情和乏情奶牛，却无法获知乏情奶牛体内代谢和生殖机能异常的变化，查明奶牛乏情的真正病因，为奶牛乏情提供有效的防治策略。究其原因是至今缺乏可用于监测奶牛产后乏情的有效的、实用的特征性生物标示物，这已成为当前高产奶牛产后繁殖障碍亟需解决的关键问题之一。

2 蛋白质组学的研究现状

2.1 蛋白质组学（Proteomics）的研究内容 1994年，澳大利亚Wilkins等首先提出了蛋白质组学的概念[20]。蛋白质组学指由一个基因组或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。它是对应于一个基因组的所有蛋白质构成的整体，而不是局限于一个或几个蛋白质。由于同一基因组在不同细胞、不同组织的表达情况各不相同，即使是同一细胞，在不同的发育阶段和不同的生理条件甚至不同的环境影响下，其蛋白质的存在状态也不尽相同。因此，蛋白质组学是一个在空间和时间上动态变化着的整体[21]。蛋白质组学研究的主要内容包括蛋白质的表达模式和蛋白质的功能模式两个方面。蛋白质表达模式的研究是蛋白质组学研究的基础内容，主要研究特定条件下某一细胞或组织的所有蛋白质的表征问题[22]。蛋白质组学研究主要有3方面内容：（1）功能蛋白质组学：对某个体系的蛋白质组进行鉴定并详细阐述其翻译后修饰的特性及其功能；（2）差异蛋白质组学，即比较蛋白质组学：以重要生命过程或重大疾病为对象，比较细胞或机体在生理和病理过程中的蛋白质表达变化；（3）相互作用蛋白质组学：通过多种先进技术研究蛋白质之间的相互作用，绘制某个体系的蛋白质间相互作用和联系的网络图谱[23]。

2.2 蛋白质组学的主要研究技术 蛋白质组学的研究技术一般分为样品制备技术、蛋白质分离技术、蛋白质定量分析技术、蛋白质鉴定技术、蛋白质之间的相互作用技术和生物信息学分析[24]。蛋白质分离技术包括双向凝胶电泳（two-dimensionaldifferential gelelectrophoresis，2-DE）、高效液相色谱技术（high performance liquid chromatography，HPLC）和毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）。蛋白质鉴定技术主要是质谱（mass spectrometry，MS），传统的蛋白质组学技术一般是应用荧光双向差异凝胶电泳（fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis，2D-DIGE）与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（matrix associated laserdesorption ionization time of flightmass spectrometry，MALDI-TOF-MS）相结合的方法分离和鉴定蛋白质的。随着蛋白质组学的研究技术平台的发展，同位素标记蛋白质相对和绝对定量分析（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ）技术、表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（surface-enhanced laser desorption/ionization time of flightmass spectrometry，SELDI-TOFMS）和电喷雾质谱技术也凭借其操作简单和样品选择范围广等优势被越来越多的应用[25]。

2.3 蛋白质组学的应用 蛋白质组学的研究虽起步较晚，但进展迅速。越来越多对动物方面的研究也应用蛋白质组学的思维方向，以及蛋白质组学的技术平台，对其动物研究方向进行分子水平的研究。蛋白组学可用于监测疾病发生的机制。Kerstin N Euler等人[26]利用2-DE结合MS技术研究牛新生儿全血细胞减少症，检测到几个与凝血相关和免疫调节的蛋白，缩小了引起其发生的蛋白质的范围，为该病免疫机制的研究奠定了基础。Zhou D H等人[27]利用2-DE结合MALDI-TOF/TOF技术发现了鼠脑部早期形成弓形虫囊蚴时脑部蛋白的变化，寻找出了60个差异表达蛋白，显示了弓形虫囊蚴蛋白和正常脑部蛋白的差异，阐明了弓形虫脑炎的发病机制。舒适等人[25]应用2D-DIGE/MALDI-TOF-MS技术分离和鉴定了13种差异表达蛋白，应用生物信息学技术探究了这些差异蛋白与疾病可能存在的关系，阐明奶牛乳热发生机制和判定病情与防治效果提供了新的方向。蛋白质组学技术还可以用来寻找疾病早期的蛋白标记物，为疾病的早期诊断提供依据。George J等人[28]利用2-DE结合MS寻找到哺乳动物溴氰菊酯中毒引起的潜在的皮肤肿瘤早期的蛋白标记物，为肿瘤发生的早期诊断提供了依据。

3 蛋白质组学在奶牛产后乏情研究中的应用

为了更好的理解奶牛产后乏情的机制以及其预防，需要从以下3个方面进行研究：分娩前后疾病对繁殖的影响；影响排卵的基因；在代谢信号和内分泌轴及生殖器官之间起重要连接作用的蛋白的影响[29]。S.Z.El-Zarkouny[30]等人研究了乏情奶牛的血清代谢物和激素的变化，检测了多种生化指标和激素，发现产后不发情与低钾、低体况评分和血清尿素氮升高密切相关。R.J.Hawken[31]等也研究了与肉牛生殖系统有关的基因，发现SNP（single nucleotide polymorphisms）与牛的生殖系统密切相关。但有关能量负平衡引起蛋白改变从而使代谢信号改变的相关研究尚未涉及。

大量文献证实，能量代谢障碍不仅是酮病、脂肪肝、糖尿病等奶牛主要代谢病的主要危险因素，而且与机体其他各系统如生殖系统许多重要疾病如乏情、胎衣不下、子宫内膜炎等有密切关系，已成为奶牛围产期健康的主要威胁之一。虽经长期的探索，因能量负平衡所致的奶牛产后乏情发病机理仍不十分清楚，但现已公认它是由多基因、多因素导致的一类复杂性生理异常过程[32]。因此，需要从不同角度、不同层次进行系统、深入研究并通过综合分析才能对其有一个较为全面的了解。随着功能基因组学、蛋白质组学理论和研究技术的兴起和发展，我们可以利用蛋白质组学技术研究与能量负平衡密切相关的奶牛产后乏情，以寻找特异性生物标志物群及其代谢过程为目标，深入探讨和全面了解其发生、发展机制和生理、病理状态，为疾病诊断和发现更有效的综合治疗方法提供理论和实验依据。

4 展望

近10年来，蛋白质组学技术的迅速发展，给研究者提供了全景式、全面系统的方法揭示疾病发生发展的平台，为探究更多的、新的生物标识物提供了方法学基础。集成蛋白质组学多项技术深入系统的探讨泌乳早期能量负平衡对奶牛乏情的调控作用机制，对丰富和发展奶牛发情期能量调控作用具有重要的理论和现实意义，为奶牛乏情的早期诊断提供理论依据。相信未来我们会运用这些科学技术解决奶牛乏情这一养殖业重要问题，从而更有效的提高奶牛繁殖效率，进而促进奶牛养殖业的健康发展。

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