FMNL3基因转染对结直肠癌SW480细胞EMT和体外侵袭能力的影响*

曾元凤,肖移生,罗小江,胡国柱,路名芝,吴晓牧,辛洪波

(1.江西省人民医院病理科,江西南昌 330006;2.江西中医药大学基础医学院形态学教研室,江西南昌,330004;3.江西省人民医院普外科,江西南昌 330006;4.江西省人民医院干细胞重点实验室,江西南昌 330006;5.江西省人民医院神经内科,江西南昌 330006;6.南昌大学转化医学研究院,江西南昌, 330031)

FMNL3基因转染对结直肠癌SW480细胞EMT和体外侵袭能力的影响*

曾元凤1,肖移生2,罗小江3,胡国柱4,路名芝1,吴晓牧5△,辛洪波6▲

(1.江西省人民医院病理科,江西南昌 330006;2.江西中医药大学基础医学院形态学教研室,江西南昌,330004;3.江西省人民医院普外科,江西南昌 330006;4.江西省人民医院干细胞重点实验室,江西南昌 330006;5.江西省人民医院神经内科,江西南昌 330006;6.南昌大学转化医学研究院,江西南昌, 330031)

目的探讨成蛋白样3型蛋白(FMNL3)基因转染对结直肠癌SW480细胞上皮-间质转化(EMT)和体外侵袭能力的影响｡方法 将带绿色荧光蛋白的重组FMNL3表达质粒pEGFP-N1/FMNL3转染至SW480细胞中(以未转染质粒的SW480细胞作正常对照,转染空载质粒的SW480细胞为阴性对照),荧光定量PCR(RT-qPCR)和 Western blot法检测重组质粒转染前､后细胞FMNL3mRNA和蛋白的表达变化;在荧光显微镜下观察FMNL3转染前､后SW480细胞的形态变化;采用RT-qPCR和Western blot检测转染前､后SW480细胞EMT上皮标志物E-cadherin和间质标志物Vimentin的表达变化;用Transwell小室实验检测FMNL3基因转染对SW480细胞的体外侵袭能力的影响｡结果FMNL3转染48h后SW480细胞中FMNL3mRNA和蛋白表达水平明显提高(P0.01);FMNL3蛋白表达于细胞质中,转染FMNL3基因后SW480细胞的形态发生了明显的改变,由典型的圆形､多边形变成梭形并伸出多个细长突起的间充质样,呈现典型的EMT形态学改变;转染FMNL3基因后,SW480细胞中EMT上皮标志物E-cadherin表达下调,间质标志物Vimentin表达上调;转染FMNL3基因后SW480细胞的体外侵袭能力显著增强｡结论FMNL3基因可能通过促进结直肠癌细胞EMT而促进其侵袭｡

结直肠肿瘤;成蛋白样3型蛋白;上皮-间质转化;侵袭

转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因｡已有研究发现上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在肿瘤细胞侵袭和转移中起重要作用[1]｡因此,对结直肠癌EMT发生机制的研究,将有助于揭示结直肠癌侵袭､转移的调控机制,并可能为结直肠癌治疗靶点的寻找提供坚实的理论依据｡新近发现的成蛋白样3型蛋白(formin-like,FMNL3)属Diaphanous相关成蛋白(Diaphanous-related formins,DRFs)家族成员,该家族蛋白是目前发现的一类最有效的细胞骨架装配和组建的关键调控分子,其在肿瘤转移中的作用已引起人们的广泛重视[2]｡目前有关FMNL3的表达和功能学研究文献甚少,其是否与结直肠癌EMT和侵袭､转移相关尚少见文献报道｡因此,本课题将初步探讨FMNL3基因转染对结直肠癌SW480细胞EMT及体外侵袭能力的影响｡

1 材料与方法

1.1 材料 (1)细胞株和质粒:结直肠癌细胞株SW480及pEGFP-N1质粒为江西省人民医院中心实验室自存;自行构建FMNL3重组表达质粒 pEGFP-N1/FMNL3;Transwell小室(8μm孔径)购自 Corning公司｡(2)主要试剂:LipofectamineTM2000､各种引物购自Invitrogen公司;灾光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒购自TOYOBO公司;蛋白提取试剂盒购自南京凯基公司;BCA蛋白定量试剂盒和化学发光液购自碧云天公司;鼠抗人FMNL3一抗购自Abnova公司,兔抗人E-cadherin和Vimentin一抗购自CST公司,羊抗兔二抗购自中杉金桥公司｡

1.2 方法

1.2.1 基因转染实验 自行构建FMNL3重组表达质粒pEGFP-N1/FMNL3,经鉴定正确后将其转染SW480细胞｡转染前24h将细胞接种于24孔板中,待细胞生长至90%～95%汇合时进行基因转染实验:用50μL的Opti-MEM稀释1μg重组质粒并混匀;取2μL的LipofectamineTM2000用50μL的Opti-MEM稀释并混匀;室温孵育5min后将两液混匀;室温孵育20min后均匀加入SW480细胞培养孔中,培养6h后换完全培养液｡实验组转染FMNL3重组质粒(SW480/FMNL3组),阴性对照组转染空载质粒(SW480/mock组),正常对照组未进行质粒转染(SW480/NC组)｡

1.2.2 RT-qPCR及 Western blot法检测重组质粒转染细胞后FMNL3的表达 转染后48h收集细胞,用TRIZol试剂按说明书提取细胞总RNA,然后进行RT-qPCR反应｡采用Prime 5.0自行设计并由Invitrogen公司合成,FMNL3的RT-qPCR检测引物如下,上游引物:5′-TCC GAT TCA TTC GTT CTT AC-3′,下游引物:5′CCG CCT CAA CTC TGC TAT T-3′,产物长度173bp;GAPDH 内参引物如下,上游引物:5′-ACG GAT TTG GTC GTA TTG GGC G-3′,下游引物:5′-CTC CTG GAA GAT GGT GAT GG-3′,产物长度138bp｡应用IBM7500定量PCR仪进行RT-qPCR实验,反应条件为95℃预变性30s､95℃变性5s､55～60℃退火30s,45个循环｡定量的方法参照文献[3],用Folds=2-△△Ct表示实验组与对照组目的基因表达的倍比关系,公式如下△△Ct=(Ct目的基因-CtGAPDH)实验组-(Ct目的基因-CtGAPDH)对照组｡实验重复3次,计算平均值｡用南京凯基公司的蛋白提取试剂盒抽提各组细胞总蛋白,BCA法定量蛋白｡取细胞总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转到PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭1h,FMNL3-抗(1∶500)4℃孵育过夜,二抗(1∶500)室温1h,用化学发光液在暗室内显影､曝光成像｡

1.2.3 FMNL3基因转染前､后SW480细胞形态检测 因重组质粒含有编码绿色荧光蛋白EGFP的基因,转染细胞后能发出绿色荧光,转染48h后可在倒置荧光显微镜下观察SW480细胞的形态学变化｡

1.2.4 FMNL3基因转染前､后SW480细胞的体外侵袭能力变化 实验前将Transwell小室滤膜按每孔50μL包被Matrigel胶并在培养箱中聚合2h,消化细胞并用无血清的RPMI-1640培养液重悬,调整细胞浓度至1×105/mL后,将细胞接种于上室,下室用常规培养基作趋化因子,培养24h后取出滤膜,4%多聚甲醛固定､Gimsa染色,光镜下随机挑取5个视野计数穿膜细胞数,取其均值代表浸润力量值｡

1.2.5 RT-qPCR及 Western blot法检测细胞中EMT上皮及间质标志物的表达 方法步骤同1.2.2,其中 Anti-E-Caherin和Anti-Vimentin均1∶1 000｡

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析,计量资料用±s表示,RT-qPCR､Western blot及体外侵袭实验结果均采用单因素方差分析｡以P0.05为差异有统计学意义｡

2 结 果

2.1 重组表达质粒pEGFP-N1/FMNL3转染SW480细胞后FMNL3表达水平 FMNL3重组表达质粒pEGFP-N1/FMNL3经双酶切及测序鉴定证实序列完全正确,说明FMNL3表达载体构建成功｡转染SW480细胞48h后FMNL3mRNA表达水平提高约53.47倍(P0.01),蛋白表达约8倍(图1),说明FMNL3已经成功转染入SW480细胞中｡

图1 3组SW480细胞中E-Cadherin和Vimentin蛋白表达水平比较

2.2 FMNL3基因转染前､后SW480细胞形态观察 倒置荧光显微镜下观察FMNL3转染前､后SW480细胞的形态,结果显示,FMNL3蛋白表达于细胞质;FMNL3转染后SW480细胞形态变化显著,由典型的圆形､多边形变成梭形并伸出多个突起的间充质细胞样(图2),呈现出典型的EMT形态学改变｡

2.3 EMT上皮及间质标志物的表达变化 RT-qPCR及Western blot法检测结果显示,与SW480/NC组比较,SW480/FMNL3组细胞E-cadherin mRNA表达水平下调55%,而Vimentin的mRNA表达上调15.47倍,其蛋白表达变化趋势与mRNA水平的表达变化一致｡

图2 倒置荧光显微镜下观察3组SW480细胞的形态学改变(×200)

图3 显微镜下观察3组SW480细胞的体外侵袭能力(×200)

2.4 FMNL3基因转染前､后SW480细胞的体外侵袭能力变化 Transwell体外侵袭实验观察到,48h后各组细胞均已穿出微 孔 滤 膜 (图 3､4),SW480/NC 组､SW480/mock 组､SW480/FMNL3组显微镜下计数穿膜细胞数分别为(125.78±20.12)个､(125.46±16.59)个､(164.78±23.37)个,FMNL3转染后SW480细胞的体外侵袭能力显著增强(P0.05)｡

图4 3组SW480细胞的体外侵袭能力变化统计图形

3 讨 论

FMNL3基因编码产物属DRFs家族成员,该家族是一类细胞中普遍存在､高度保守的多功能蛋白家族,通过其保守的FH2结构域促进肌动蛋白单体聚合并加快肌动蛋白纤维延伸,是目前发现的细胞中最有效的肌动蛋白成核因子之一[4];作为细胞骨架组建和装配的关键调控分子,其参与了众多以肌动蛋白为基础的生命过程,包括细胞质分裂､细胞极性和运动､伪足形成等[5-6]｡目前研究已经发现,该家族与Rho细胞运动信号通路相关,通过调控细胞骨架如丝状伪足､板层伪足等的形成而影响肿瘤细胞的运动､侵袭和转移能力[2]｡

FMNL3是新近发现的基因[7],位于染色体12q13｡目前有关其表达和功能学研究文献甚少,生物信息学分析显示其在脾脏､卵巢纤维瘤､横纹肌肉瘤､胃癌中表达[7];有研究发现在体内高运动能力的黑色素细胞亚群中存在FMNL3的高表达[8];FMNL3调控肌动蛋白的成核和延伸[9],与血管形成过程中内皮细胞的细胞骨架重组有关[10],并能促进细胞骨架丝状伪足的形成[11],FMNL3依赖RhoC诱导前列腺癌细胞迁移[12-13];但FMNL3是否与结直肠癌EMT相关目前还少见文献报道｡本课题前期研究中用免疫组织化学和RT-qPCR法检测结直肠癌组织和多个细胞系中FMNL3､EMT上皮和间质标志物的表达发现,FMNL3在结直肠癌原发灶组织中的表达高于对应癌旁正常组织,在淋巴结转移灶组织中的表达高于其原发灶组织[14];同时发现FMNL3的表达与EMT上皮标志物的表达呈负相关,而与间质标志物呈正相关;FMNL3及间质标记物Vimentin在高转移潜能细胞系(SW620和LOVO)中的表达高于其在低转移潜能细胞系(SW480和HT29)中的表达,而上皮标记物的表达趋势正好相反[15];这提示FMNL3可能与结直肠癌EMT相关｡在本研究中也发现,转染FMNL3基因后SW480细胞的形态发生明显变化,由圆形或多边形变为梭形并伸出多个细长突起的间充质样,呈现典型的EMT形态学改变;并且不论mRNA水平还是蛋白水平,与SW480/Mock组细胞相比,SW480/FMNL3组细胞中上皮标志物E-cadherin表达均降低,间质标志物Vimentin表达均升高,这进一步说明FMNL3可能促进结直肠癌细胞EMT,与本课题的前期研究结果相吻合;同时还发现,转染FMNL3基因后SW480细胞的体外侵袭能力显著增强,说明在体外FMNL3能够促进结直肠癌细胞侵袭｡综合以上研究结果,本研究认为FMNL3可能通过促进结直肠癌细胞EMT而促进结直肠癌侵袭,但具体的分子机制还有待进一步深入研究｡

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Influence of FMNL3 gene transfection on epithelial-mesenchymal transition and in vitro invasion potential of colorectal carcinoma SW480 cells*

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(1.,,, 330006,;2.,,,, 330004,;3.,,, 330006,;4.,,, 330006,;5.,,, 330006,;6.,,, 330031,)

ObjectiveTo investigate the impact of FMNL3gene transfection on the epithelial-mesenchymal transition(EMT)and the in vitro invasive potential of colorectal carcinoma SW480cells.MethodsThe recombination FMNL3expression plasmid with EGFP was transfected into SW480cells(SW480cells without transfected plasmid as the normal control group and SW480cells with empty vector as the negative control group).The changes of FMNL3mRNA and protein expression were detected by real-time PCR and Western blot after transfection of 48hwith recombination FMNL3expression plasmid.The changes of SW480cell morphology were detected by the fluorescence microscope after FMNL3transfection.The changes of EMT epithelial and mesenchymal markers in SW480cells were detected by real-time PCR and Western blot after FMNL3transfection.The Transwell chamber invasion assay in vitro was used to investigate the effects of FMNL3gene trasfection on the invasive potential of SW480cells.ResultsThe levels of FMNL3mRNA and the protein expression were significantly increased at 48hafter transfection with recombination FMNL3expression plasmid(P0.01);the FMNL3protein was expressed within cytoplasma,the morphology of SW480cells after FMNL3transfection showed significantly changes from round and polygon to spindle and stretched out the multiple long and thin prominences as mesenchyma,which appeared the typical EMT change;after FMNL3gene transfection,the expression of EMT epithelial marker E-cadherin was down-regulated and the expression of mesenchymal marker Vimentin was up-regulated in SW480 cells;the in vitro invasive potential of SW480cells was remarkably enhanced after FMNL3transfection.ConclusionFMNL3gene may promote its invasion by promoting EMT of colorectal carcinoma.

colorectal cancer;FMNL3;epithelial-mesenchymal transition;invasion

* 基金项目:国家自然科学基金资助项目(81201972､81260327)｡

曾元凤(1974-),主治医师,博士后在站工作人员,主要从事结直肠癌转移的分子机制研究｡△

,Tel:(0791)8895633;E-mail:wuxm@163.com｡▲通讯作者,Tel:(0791)83827168;E-mail:hongboxin@yahoo.com｡

10.3969/j.issn.1671-8348.2014.12.018

A

1671-8348(2014)12-1460-03

2013-10-20

2013-12-05)

论著•临床研究