肝母细胞瘤中的干细胞表面标记物的初步识别＊

张守华，肖菊花，邓庆强，徐红艳，罗 鸣，谌卫龙，雷 俊，陶 强△

（1.江西省儿童医院普外科，南昌 330006；2.江西省妇幼保健院超声诊断科，江西南昌 330006）

肝母细胞瘤中的干细胞表面标记物的初步识别＊

张守华1，肖菊花2，邓庆强1，徐红艳1，罗 鸣1，谌卫龙1，雷 俊1，陶 强1△

（1.江西省儿童医院普外科，南昌 330006；2.江西省妇幼保健院超声诊断科，江西南昌 330006）

目的初步筛选出肝母细胞瘤（HB）中的肿瘤干细胞（NSC）相关表面标记组合，并了解NSC的分布。方法选择入住江西省儿童医院并接受手术的HB患儿，采用免疫组织化学染色的方法，观察干细胞相关标记物CD34、Thy-1、c-kit、CD56和干细胞生长因子（SCF），在HB组织及距肿瘤组织边缘3cm以外的正常肝脏组织的表达和分布。结果Thy-1、c-kit散在分布于HB组织中，主要集中在汇管区，而正常肝脏组织中不表达；CD34及SCF在HB中的表达明显高于正常肝脏组织（P＜0.05），其中CD34主要在血管内皮系统中分布，SCF主要表达在汇管区；CD56表达于成簇的神经纤维组织中，在HB及正常肝脏组织中表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结论不同干细胞相关表面标志物分布于HB组织中，并且集中表达在特定区域。表达Thy-1／c-kit阳性细胞可能对HB的发生起一定作用。

肿瘤干细胞；肝母细胞瘤；抗原，CD34；抗原，Thy-1；原癌基因蛋白质c-kit

肿瘤干细胞（neoplastic stem cells，NSC）的存在已在许多肿瘤细胞株及原发性肿瘤中得到了证实。NSC学说认为，肿瘤组织由异质性的细胞组成，其中有极少部分细胞亚群具有起始肿瘤的能力，它们虽然数量极少，却在肿瘤发生、转移和复发中起重要作用。目前如白血病、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌等中均证实了NSC的存在［1］，可是肝母细胞瘤（hepatocastoma，HB）的NSC却一直未能确定，而筛选出合适的表面标记组合是有效分离和鉴定NSC的前提。本文旨在初步探讨HB的NSC相关表面标记物存在的合理性，为后续的NSC标记物分离和确定提供依据和参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2002～2012年江西省儿童医院普外科收治的HB患儿8例（肿瘤组），其中男5例，女3例，年龄15d～10岁，平均发病年龄为19.8个月，术前未经放疗、化疗，8例患儿均手术完整切除并经病理检查诊断为HB，根据病理分型，其中上皮型4例，混合型4例。取距肿瘤组织边缘3cm以外的正常肝脏组织作为对照组。

1.2 方法 标本组织离体后立即取材，并以4% 多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm切片。石蜡包埋组织切片经常规脱蜡至水，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，山羊血清封闭，抗原修复，然后采用常规SP免疫组织化学方法检测CD34、Thy1、c-kit以及干细胞生长因子（SCF）和CD56的蛋白表达情况。由两位病理科医生独立阅片，在光学显微镜下观察阳性细胞的分布特征。以出现棕黄色、高出背景色者为阳性细胞。选取具有代表性的肿瘤区域，在高倍镜下（×400）随机选取10个视野，记录阳性细胞占组织细胞的百分率。

1.3 统计学处理 采用SPSS15.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料用±s表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

本文8例患儿 HB组织中均可见到表达CD34、Thy-1、ckit、SCF和CD56阳性细胞，其中Thy1、c-kit散在分布于肿瘤组织，主要集中在汇管区（图1A、B），而在正常肝脏组织中不表达（图1C）；CD34主要表达于血管内皮系统，HB组织中的表达明显高于正常肝脏组织（图1D、E，P＜0.05）；SCF阳性细胞主要分布于汇管区，HB中的表达明显高于正常肝脏组织（图1F、G，P＜0.05）；CD56表达于成簇的神经纤维组织中，二者表达差异无统计学意义（图1H，P＞0.05）。两组CD34、SCF和CD56的表达比较，见表1。

图1 HB及正常肝脏组织中相关标记物表达（×400）

表1 两组CD34、SCF等表达比较（±s，n＝8）

表1 两组CD34、SCF等表达比较（±s，n＝8）

组别0.32±0.09 0.43±0.09 0.11±0.04对照组 0.17±0.07 0.11±0.04 0.09±0.09 P＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 CD34 SCF CD56肿瘤组

3 讨 论

HB是小儿最常见的肝脏原发性恶性肿瘤，在小儿恶性实体性肿瘤中，HB发病率仅次于肾母细胞瘤和神经母细胞瘤，位于第3位［2］。儿童HB是一种胚胎性肿瘤，其有未成熟的胚胎性组织，这些组织持续增生，形成发育幼稚的组织块而可能转化成恶性的母细胞瘤。HB病理组织学上可分为上皮型及混合型［3］。上皮型又分为4个亚型：胎儿性、胚胎型、巨梁型、小细胞未分化型。HB明确的发病机制尚未完全明了，有学者认为可能与染色体异常、低出生体质量、母体妊娠期不良外界因素等有关。HB的预后不容乐观，特别是在中国，由于患儿就诊较晚，手术完整切除率低，治疗不规范，3年生存率小于50%［4］。但近年NSC理论的出现在一定程度上为HB的发病机制、治疗和预后提供了新的视角。该理论认为，NSC是存在于肿瘤细胞中的一个亚群，具有高度自我更新及无限增殖能力，呈不对称分裂，大量事实证实其与肿瘤发生、侵袭、转移、复发及耐药密切相关。许多肿瘤如乳腺癌、前列腺癌等，均分离出了NSC，但HB的NSC表面标记物一直未能确定。

卵圆细胞是人们目前公认的肝组织中的肝源性肝干细胞，是肝内胆管系统源性的多潜能分化细胞群，可以分化为胆管上皮细胞和肝细胞［5］。OV6、SCF、c-kit、CK-8、CD34、CD49、Thy－1、AFP等被认为是卵圆细胞表达相对较高的标志物，其某些标志物可以作为今后肝NSC筛选的参考标志物。本研究基于此前对肝脏干细胞的研究，结合文献［6-7］报道，初步设想HB的NSC相关几个表面标记物并验证其合理性。本研究采用免疫组织化学染色的方法，观察表达CD34、Thy1、c-kit、SCF和CD56的阳性细胞在HB组织及正常肝脏组织的表达情况和分布，结果发现，Thy-1、c-kit散在分布于 HB组织，主要集中在汇管区，而正常肝脏组织中表达为阴性。Thy-1是相对分子质量为25～37×103的细胞表面糖蛋白，通过二酰甘油（DAG）锚定于糖基磷脂酰肌醇（GPI）的C末端而附着在细胞膜的胞浆面，参与细胞的分化、识别、迁徙等功能。人类许多实体瘤细胞（包括脑瘤、皮肤癌）中都有Thy-1的表达，广泛分布于许多恶性肿瘤中。有研究表明在某些肿瘤如肝癌、肺癌等组织中，其表达情况与病理类型、肿瘤转移以及预后密切相关。Yang等［8］从肝癌细胞株和肝癌组织中筛选出Thy-1阳性细胞，异种移植入重症复合型免疫缺陷病小鼠体内，发现其有致瘤性，病理提示符合肝细胞肝癌的诊断，进一步指出Thy-1阳性肝癌细胞具有自我更新、多向分化和高致瘤性等生物学特性，是肝癌干细胞的特异性标志物。c-kit基因位于人染色体4q12-13，属于原癌基因，其产物是Ⅲ型酪氨酸激酶，编码145×103的跨膜糖蛋白，c-kit受体分布于细胞表面，结构类似于粒－巨核细胞集落刺激因子（GM-CSF）和血小板源生长因子受体（PDGFR）［9］。c-kit与其配体结合后，诱导其胞外区的构象发生变化，使受体在细胞膜上迁移、聚集，形成二聚体，使得酪氨酸激酶磷酸化，继而激活酪氨酸激酶功能区，细胞质内多个蛋白质持续磷酸化，这些效应分子的磷酸化促发细胞间信号的瀑布级链反应，调控c-kit的下游底物，包括 MAPK、Ras-Raf-MAP、JAK／STAT等多条信号传导通路，最终活化细胞质内的转录因子，从而调节基因表达，控制细胞生长、增殖和分化［10］。诸如急性髓细胞白血病、肺癌、肝癌等恶性肿瘤均有c-kit的表达，有些肿瘤如胃肠道间质瘤，甚至认为c-kit是其特征性标记物［11］。c-kit基因诱导肿瘤有两种方式，（1）c-kit基因的过表达，激活下游信号通路，引起肿瘤的过度增殖所导致；（2）c-kit基因发生突变，导致非配体依赖性的受体二聚体形成，从而激活c-kit的酪氨酸激酶活性，并持续刺激下游的信号转导通路，引起细胞不断的生长、增殖，最终成为肿瘤细胞［12］。结合Thy-1和ckit的特性本研究发现，其主要在HB组织的汇管区表达，而在正常肝组织中不表达或表达极少。由此，本研究推测Thy-1／ckit阳性细胞可能在HB的发生起一定作用。

SCF又称肥大细胞生长因子，SCF可以促使处于G0期的干细胞进入细胞分裂周期，以此促进干细胞的增殖和分化。另外，SCF还可抑制细胞凋亡过程，从而提高细胞的存活力［13－14］。SCF在人体肝脏、骨髓、胎盘、睾丸和肾脏等多种组织和细胞中都有表达，特别是干细胞群体更是高表达。有研究表明，在肺癌、神经系统肿瘤、前列腺癌等均有c-kit和SCF共表达现象。CD34在血管内皮细胞均有表达，在肿瘤组织中是判断新生血管、侵袭性、恶性程度的重要指标［15］。本实验中发现CD34及SCF在HB组织中的表达明显高于正常肝组织，这可能与肿瘤新生血管、恶性程度有关，与NSC的关系有待进一步研究。CD56是神经细胞黏附分子的一种糖蛋白，位于中枢和外周神经细胞及纤维膜表面，在神经系统的生长发育发挥重要作用。本实验发现CD56均表达于HB以及正常肝脏组织中成簇的神经纤维组织，二者在数量、分布未见明显差异。

HB是儿童最常见的肝脏原发恶性肿瘤，其最基本的治疗方法是手术切除或通过化疗增加可切除的HB病例数［16］。但部分病例因原发性、继发性或多药耐药性而对化疗不敏感，预后极差。NSC理论在一定程度上为治疗提供了新的视角，鉴定和筛选HB中NSC并了解表面标记组合的相关调控机制和信号通路，对发现潜在的药物靶点，进而为临床治疗、提高治愈率和长期存活率都具有重要意义。

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Preliminary recognition of stem cells surface markers in hepatoblastoma＊

ZhangShouhua1，XiaoJuhua2，DengQingqiang1，XuHongyan1，LuoMing1，ChenWeilong1，LeiJun1，TaoQiang1△
（1.DepartmentofGeneralSurgery，JiangxiProvincialChildren′sHospital，Nanchang，Jiangxi330006，China；
2.DepartmentofUltrasoundDiagnosis，JiangxiProvincialMaternalandChildHealthCareHospital，Nanchang，Jiangxi330006，China）

ObjectiveTo preliminarily screen the neoplastic stem cell（NSC）related surface markers combination and to understand the NSC distribution in hepatoblastoma（HB）.MethodsThe children cases of HB undergone the surgical therapy in the Jiangxi Provincial Children′s Hospital were selected.The immunohistochemical method was adopted for observing the expression and distribution of NSC-related markers CD34，Thy-1，c-kit，CD56and stem cell factor（SCF）in the HB tissue and the normal hepatic tissue away from the edge of tumor tissue 3cm outside.ResultsThy-1and c-kit were sporadically distributed in the HB tissue and mainly focued on the portal area，but did not exressed in the normal liver tissue；the expression of CD34and SCF in HB was significantly higher than that in the normal liver tissue（P＜0.05），in which CD34was mainly distributed in the endothelial system and SCF was mainly expressed in the portal area；CD56was expressed in the tissue of the clustered nerve fibers，the expression difference between them had no statistical significance（P＞0.05）.ConclusionThe different NSC related surface markers are distributed in the HB tissue and focus on the specific areas.The positive cells of Thy-1／c-kit expression may play a role in the HB occurrence.

neoplastic stem cells；hepatoblastoma；antigens，CD34；antigens，Thy-1；proto-oncogene proteins c-kit

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.10.020

A

1671-8348（2014）10-1208-03

江西省卫生厅课题资助项目（20131137）。

张守华（1982－），主治医师，硕士研究生，主要从事儿童肿瘤以及干细胞研究。△

，Tel：13979170606；E-mail：taoqiang＿2008＠126.com。

2013-09-18

2013-11-25）

·论 著·