与HBV preS1黏附相关的细胞受体的研究＊

王良宏，杨 丽，潘 卫，李 兴，杨国珍△

（1.贵阳医学院医学检验学院，贵州贵阳550009；2.四川大学华西第二医院生殖中心，四川成都610041）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）严重危害人类健康，目前临床常用的抗病毒药物对慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的治疗效果并不十分理想，药物不能有效地阻止HBV在细胞内的复制和再感染。HBV感染早期，病毒与细胞相互作用的机制并不清楚，这可能会影响到药物的设计与治疗方案的更新。HBV通过外膜蛋白与肝细胞膜上的特异受体相互识别，黏附于细胞膜上［1］，这种特异性的识别和黏附是HBV感染嗜性（组织和宿主特异性）的原因之一。大量研究显示，HBV的preS1肽段不仅直接参与了病毒与细胞的结合，而且其作用是十分关键和必需的［2－3］。肝细胞受体识别位点在preS1的21～47表位［4－7］。本课题以人肝癌细胞（HepG2）为实验对象，采用免疫磁珠法分离与preS1肽段结合的受体蛋白［8］，以期发现与HBV感染相关的受体蛋白，从而为HBV感染早期与细胞相互作用机制的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞株：HepG2细胞购自中国科学院细胞库。试剂：生物素标记preS1肽段购自赛百盛生物公司，链霉亲和素标记的磁珠购自柏汇申生物科技有限公司，细胞核－细胞质－细胞膜制备试剂盒购自普利莱基因技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清、双抗（青霉素100U／mL，链霉素100mg／mL）的DEME高糖培养基，于5%CO2、37℃恒温培养HepG2细胞。

1.2.2 细胞膜蛋白的提取 收集大约2×107个细胞，严格按照细胞核－细胞质－细胞膜制备试剂盒的说明书进行提取。

1.2.3 免疫磁珠法分离与preS1结合的蛋白 取2mg膜蛋白同300μL生物素标记的preS1，加PBS至1mL，4℃孵育过夜。次日取出后加入浓度为0.15g／L的链霉亲和素标记磁珠300μL，补足PBS至1 200μL，37℃摇床孵育30min。将Epp管插入磁力架，吸出未结合的部分，然后用PBS将磁珠洗涤3次，弃PBS，加入裂解液30μL冰浴30min，将与preS1结合的蛋白裂解出来。

1.2.4 十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白 将裂解的蛋白液用5%的浓缩胶，12%的分离胶进行SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝R-250染色，UMAX扫描仪进行扫描。

1.2.5 质谱分析及数据库检索 选取在凝胶中颜色较深且重复性好的6条带进行质谱鉴定。LC-MS／MS质谱分析及检索由中国科学院动物研究所生物膜与膜生物工程国家重点实验室完成。

2 结 果

2.1 HepG2细胞膜蛋白与preS1结合蛋白的分离结果2mg HepG2膜蛋白与300μg的preS1结合，经300μL链霉亲和素标记磁珠获得的结合蛋白，通过SDS-PAGE分离出了16条带（图1），（45～97）×103的有9条带，＞97×103的有5条带，＜20×103的有2条带。

2.2 HepG2细胞膜蛋白与preS1结合蛋白的质谱分析 选取其中颜色较深且重复性好的6条带（图1）进行了质谱分析，成功分析出14个蛋白，除Act1p属酵母菌科外，其余均为人的种属。剩余的13个蛋白包含肌动蛋白β（actin，beta）、微管蛋白β（Tubulin，beta）、ATP合酶（ATP synthase）、微管蛋白α－1A链（Tubulin alpha-1Achain）、热休克蛋白60（60kDa heat shock protein，HSP60）、角蛋白1（keratin 1）、keratin 10、表皮细胞角蛋白2（epidermal cytokeratin 2）、葡萄糖调节蛋白前体78（78kDa glucose-regulated protein precursor，GRP78）、热休克蛋白70（Heat shock 70kDa protein 9，Mortalin）以及3个未命名的蛋白。质谱鉴定独立肽段数大于或等于2，评分小于或等于1E-5为结果可靠，各蛋白质谱分析结果，见表1。

图1 SDS-PAGE分离HepG2膜蛋白与preS1结合蛋白

表1 HepG2与preS1结合蛋白的质谱结果

3 讨 论

HBV严重危害人类健康，目前临床常用的抗病毒药物对CHB的治疗效果并不十分理想，药物不能有效地阻止HBV在细胞内的复制和再感染。HBV感染早期，病毒与细胞相互作用机制的研究显得尤为重要。

本课题采用了免疫磁珠分离法，该方法是一种省时、省力、方便快捷的方法，可有效分离受体蛋白［8］。本研究成功分离鉴定出14种与preS1肽段结合的蛋白，主要包括以下几类。（1）微管蛋白：微管蛋白β，微管蛋白α-1A链。微管是构成细胞骨架的主要成分，它由微管蛋白β和微管蛋白α两个亚基结合在一起。维持细胞的形态，可影响膜内细胞器的空间定位和分布，参与物质运输及细胞内信号转导。（2）线粒体相关蛋白：ATP合酶。线粒体上的ATP合酶是一个与ATP合成和水解相关的双向酶复合物。ATP合酶主要存在于线粒体内膜，但已有研究表明在细胞表面也存在ATP合酶［9］，并且最近的研究表明ATP合酶可作为受体参与脂类代谢调控和肿瘤免疫标志识别等［10］。（3）HSP：HSP60、Mortalin、GRP78。HSP是一类所有细胞在应激状态下，由热休克基因编码合成的序列高度保守的蛋白，且能够对抗更为严重的应激损伤，这种现象称为热休克反应。HSP 60作为线粒体蛋白主要表达在细胞质［11］，涉及线粒体蛋白和大分子的组装，有利于输入蛋白的正确折叠，在线粒体基质中正确的产生多肽。王芳等［12］在文中指出，HBV感染的肝细胞会释放大量的可溶性HSP60分子，其表达水平与HBV-DNA水平呈正相关。Mortalin和GRP78均属于HSP70家族。Mortalin主要定位于线粒体，参与天然免疫和获得性免疫，有研究指出Mortalin是一种功能性膜蛋白，在细胞信号传导中扮演着重要角色。

GRP78主要存在于内质网中，但在细胞膜上也有表达，细胞膜上的GRP78参与细胞信号转导、抗原提呈及病毒入侵等。有研究证实GRP78是2型登革热病毒（dengue virus serotype 2）受体复合物的主要成分之一［13］。杨凤等［14］通过激光共聚焦显微镜观察到GRP78在细胞膜上均匀分布，并指出GRP78可能通过与preS1结合参与HBV早期感染过程，葛以跃等［15］联合利用GST Pull-Down与现代蛋白组学技术鉴定了2种与preS1特异结合蛋白：GRP78和GRP75。以上的研究提示，GRP78在HBV感染初期黏附有着非常重要的作用，其在细胞信号转导、抗原提呈等过程中发挥重要作用。GRP78能与preS1特异结合并且在肝细胞膜上表达，可能参与HBV早期侵入肝细胞的过程，本研究拟将GRP78作为preS1的候选受体，下一步将对其在HBV早期感染中的作用机制进行研究，为抗病毒药物的设计与治疗方案的更新打下基础。

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