气单胞菌外膜蛋白基因工程疫苗的研究进展

单晓枫，曹 亮，沈锦玉，陈 龙，康元环，陈亨利，钱爱东∗

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118；2.农业部淡水渔业健康养殖重点实验室，浙江省淡水水产研究所，浙江湖州，313001）

气单胞菌（Aeromonas）隶属于气单胞菌科（Aermonadaceae），是一类人-兽-鱼共患的病原菌［1］，其广泛存在于各种环境中，除引起人兽患病外，还可导致多种水生动物感染发病，严重危害水产养殖业的发展［2-4］。长期以来，对水产养殖业细菌性疾病多采用抗生素疗法进行救治，但此法极易使致病菌产生耐药性，且水生动物体内的药物残留也威胁着人类自身安全［5］，因此，预防疾病的发生就显得尤为重要。在水产养殖中，除日常管理外，疫苗的研发则是鱼病防治的重要研究方向。目前，继灭活疫苗、弱毒疫苗之后，基因工程疫苗是气单胞菌研究的重点，而气单胞菌的外膜蛋白（Outer membrane proteins，OMPs）由于具有良好的免疫原性以及交叉保护性［6-7］，可作为基因工程疫苗最具潜力的候选免疫抗原成分之一，逐渐成为水产疫苗研究的热点［8-9］。本文就气单胞菌外膜蛋白的基因工程疫苗研究进展进行综述，旨在为气单胞菌疫苗的研发提供参考。

1 气单胞菌外膜蛋白OMPs的基本特征

外膜是革兰氏阴性菌（Gram negative bacteria，G-）特有结构，存在于胞浆膜（内膜）和肽聚糖外侧，与胞浆膜共同组成G-膜系统，在维持菌体自身结构稳定及物质运输方面有重要作用［10-11］。与其他革兰氏阴性菌相同，气单胞菌外膜蛋白也是外膜中嵌合的多种蛋白的统称，根据在单细胞中的拷贝数的高低可分为主要蛋白和微量蛋白，主要蛋白包括外膜蛋白 A（OmpA）、微孔蛋白（Porins，OmpC）和脂蛋白（Lipoprotein，Lpp）等。OmpA富含 β折叠，功能上可为外膜提供通透性，同时维持菌体外膜的完整性；OmpC又称通道蛋白，它以非共价键与肽聚糖结合，形成跨越外膜的相对非特异性的通道，对营养物质（如氨基酸、二肽和双糖等）、抗菌素等的运输及离子筛选有重要作用，某些气单胞菌的OmpC（如嗜水气单胞菌）可在缺铁环境下产生铁载体，以获取更多的 Fe3+［12-13］；LPP 起到稳定细菌外膜-肽聚糖复合物的作用，同时也可参与其他营养物质的转运。微量蛋白约有10～20种，如lamB蛋白、Tsx蛋白、FepA蛋白等，气单胞菌的外膜蛋白被证明含有麦芽糖诱导的lamB同源蛋白，此外ExeD蛋白也被证实通过外膜的周质间隙（periplasmic space）来转运胞内蛋白［14］。

2 基因工程亚单位疫苗

亚单位疫苗即提取病原菌如外膜蛋白、脂多糖、外毒素等成分而制成的疫苗，而基因工程亚单位疫苗则是在其基础上，利用DNA重组技术将病原菌的外膜蛋白等组分的基因连接到相应载体中，表达出可诱导机体产生保护性抗体的蛋白，并将蛋白纯化而制成的疫苗。

Khushiramani等［15］以嗜水气单胞菌外膜蛋白OMPTS为研究对象，PCR扩增目的片段后重组表达，将纯化的蛋白免疫接种印度鲤鱼，夹心ELISA检测显示14 d和28 d抗体效价滴度分别为1∶4000和1∶12000，由此证实 OMPs具有高度的免疫原性。Khushiramani等［16］从患病鱼体中分离嗜水气单胞菌，扩增出OMP48目的基因片段后对其进行测序并比对，发现其与维氏气单胞菌OMP48相似性高达98%，用纯化的蛋白免疫接种鲮鱼，可产生69%的保护率。WANG等［17］采用鲂鱼恢复期的血清，以双向电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法分离出嗜水气单胞菌的OMP38蛋白，并将其免疫接种鲂鱼后，在注射疫苗后的45 d内，鱼体内特异性IgM含量和吞噬细胞活性均呈现较高水平，暗示重组蛋白可用于预防嗜水气单胞菌感染。Guan等［18］以气单胞菌外膜蛋白保守序列OMPG重组表达的蛋白免疫欧洲鳗鲡，可使欧洲鳗鲡分别对两株嗜水气单胞菌、一株温和气单胞菌产生70%、50%与75%的保护率，这也是首次验证了用同一OMPs疫苗可对预防不同种气单胞菌的感染。

3 核酸疫苗

核酸疫苗又称DNA疫苗，是指将外源基因连接到相应质粒上，然后将重组质粒用基因枪或肌注动物体内，使外源基因在机体内直接表达，核酸疫苗可同时诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，刺激机体产生较强的和相对较持久的免疫应答，被称为第三代疫苗。

自1996年第一个DNA疫苗应用于鱼类之后，对水生动物的DNA疫苗的研究陆续展开［19-20］，气单胞菌外膜蛋白DNA疫苗也逐渐有报道。李盼等［21］为PCR扩增嗜水气单胞菌的外膜蛋白OMP基因，并连接pcDNA3质粒载体，转染293细胞，在转染48 h后提取细胞RNA并进行PT-PCR验证，结果证实可扩增出特异性OMP片段，以此成功构建了嗜水气单胞菌外膜蛋白的DNA疫苗。Vazquez-Juarez等［22］将气单胞菌外膜蛋白两个重要的基因片段omp38和omp48连入质粒中，制成核酸疫苗，免疫接种于斑点虹鳟，在免疫4～6周后感染病原菌，结果显示该疫苗可对虹鳟产生50%～60%的保护率。

虽然DNA疫苗与传统疫苗相比具有生产成本低廉，免疫方式简单，且易保存等优点，然而DNA疫苗的免疫机制尚待研究中，且相关报道较少，目前，尚无临床应用的报道。

4 重组活载体疫苗

重组活载体疫苗是指将所编码的病原菌的特异性目的片段导入到载体质粒中，并将重组质粒导入到益生菌，以此发挥免疫效果；活载体疫苗生产成本低，安全性好，且其载体兼具佐剂功能。其中乳酸菌长期以来一直用于食品工业，被认为是安全级微生物，是活载体疫苗常用的载体。

傅罗琴等［23］以乳酸乳球菌为载体，将嗜水气单胞菌OMPA基因连接到pNZ8048表达质粒后电击转化到乳酸乳球菌中，将得到的重组乳酸乳球菌口服免疫BALB／c小鼠，一周后用间接ELISA法检测血清中免疫球蛋白含量变化，显示出IgG含量显著提高，免疫两周后，嗜水气单胞菌感染BALB／c小鼠，结果显示重组乳酸乳球菌可对小鼠BALB／c产生87.5%的保护率。虽然研究结果证实活载体疫苗对哺乳动物具有一定的保护力，但对水产动物的免疫效果仍需进一步探索。

5 鱼类基因工程疫苗免疫方式

常见的鱼类免疫方法主要包括注射、浸泡以及口服等。而基因工程疫苗如基因工程亚单位疫苗等在试验阶段常采用腹腔注射或肌肉注射免疫接种方式，DNA疫苗则以肌肉注射为主；浸泡免疫多为减毒细菌的免疫，如杀鲑气单胞菌减毒株可以通过浸泡免疫鱼而产生保护作用［24］。

而口服免疫由于抗原可能会被鱼类消化分解，为确保抗原能顺利到达吸收部位，研究人员已尝试对抗原进行包裹以抵抗不良环境的干扰。而鱼用疫苗的包裹材料要求在包裹抗原时不但要保证抗原的完整性使其具有良好的免疫原性，还要保证材料在鱼体内可自然降解，对鱼体无毒副作用，溶解速度快，口味良好等特点，这就要求科研人员在前人研究基础上，要不断探索研究新的包裹材料［25-26］。

6 气单胞菌OMPs基因工程疫苗的不足之处

气单胞菌的OMPs已被证实是一种有效的保护性抗原，未来在预防免疫鱼类疾病上具有良好的研究价值和广泛的应用前景，但将气单胞菌OMPs基因工程疫苗应用到实践中，尚需解决如下问题：

首先，虽然气单胞菌OMPs基因工程疫苗已被证实可诱导鱼体产生特异性抗体，且与传统疫苗相比其安全性高，稳定性强，但也仅限于实验性研究。对于特异性抗体水平持续的时间，免疫安全水平及免疫的机理都缺乏更深入的了解；此外，对基因工程疫苗评价体系缺乏相应的标准，这也阻碍了疫苗商品化的进程。

其次，免疫接种途径有待于进一步改善。目前鱼类免疫的主要方式以腹腔注射为主，而这种免疫方式并不适用于规模化养殖，且腹腔注射极易造成鱼体伤害，且影响其生长；相对来说口服途径免疫以更简单、方便、安全等优点更适用于大规模鱼群免疫，但由于不同种类鱼的消化系统的结构和机能不尽相同，这要求我们需不断开发新的包裹材料，使免疫效果达到最佳。

7 展望

鱼用基因工程疫苗以其在疾病防治上展现的优越性得到越来越多人的关注与研究。我实验室已对不同源性的维氏气单胞菌OMPs基因序列进行了比较分析，同时在基因工程亚单位疫苗的研究上也取得了一定的进展［27-29］，但是气单胞菌属包括多种气单胞菌，且多数具有致病性，一种气单胞菌的OMPs基因工程疫苗能否抵御多种气单胞菌的感染，一种动物源性气单胞菌OMPs基因工程疫苗能否保护其它动物也免受侵害，这都需要进一步研究。而笔者认为，将不同种的气单胞菌OMPs基因进行融合表达，不失为一种解决方案。当然，随着对鱼用疫苗研究的深入与发展，未来越来越多的高效率、高安全性的基因工程疫苗将被研制，并应用于水产养殖中，推动其健康可持续发展。

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