NMNAT的结构及其对糖代谢的影响

王大鹏 李 强

(哈尔滨医科大学附属第二医院内分泌代谢病科，黑龙江 哈尔滨 150086)

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是生物体内多种氧化还原反应的重要辅酶，也是许多NAD消耗酶的底物。烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT)是催化NAD生物合成的关键酶，它催化这一可逆反应向前进行，对维持体内NAD水平的稳态至关重要。近年来的研究发现，在NMNAT催化下的NAD生物合成水平，不仅对于SIRT1的活性有重要影响，还能在沉默信息调节因子1(SIRT1)介导下改善生物体内的葡萄糖代谢。人们还发现它对于代谢紊乱和衰老情况下胰岛β细胞功能紊乱的调节也至关重要。NMNAT在哺乳动物体内的三种亚型有着不同的亚细胞定位及组织分布，且功能各异。

1 NMNAT亚型及结构

已有研究证明，哺乳动物NMNAT存在三种亚型：NMNAT1-3，它们与啮齿类动物NMNAT的同源异构体之间氨基酸序列的相似性很高。例如人NMNAT-1与小鼠NMNAT-1之间的氨基酸序列有80%左右的同一性；NMNAT-3之间比率相仿；而NMNAT-3同源异构体之间的氨基酸序列同一性竟达99%(小鼠NMNAT多出4个氨基酸)。人NMNAT亚型之间结构各异，亚细胞定位不同，且存在于各自的染色体，由各自的基因编码。每一个种属的哺乳动物NMNAT都有其特异性且具有亲和力的二价阳离子。NMNATs也分别作用于不同底物：ITP、GTP、或其他嘌呤核苷酸底物的类似物。

有研究认为其亚细胞定位是受功能特异性靶向作用区域(ISTIDs)调控，ISTIDs由单一外显子编码，这一控制区在低级别生命体中并不存在，而且其与NMNAT的酶促反应无关。ISTIDs含有棕榈酰化、磷酸化等翻译后修饰位点，可以调节细胞内NAD池区域的划分。

人NMNAT-1是一种同源六聚体结构，其亚单位分子量为32 kD。在体内含量最为丰富，表达也最为广泛。编码它的基因定位于染色体(1p32-35)，它含有279个氨基酸残基，前四个氨基酸组成无序的羧基端。人NMNAT-1含有谷氨酸107—赖氨酸146的亚型高度特异性序列，由单一的亚型特异的外显子编码，该序列中包含了人NMNAT-1的细胞核定位信号以及调节人NMNAT-1—PARP-1反应过程的磷酸化区域，所以人NMNAT-1仅定位于细胞核。

人NMNAT-2在中枢神经组织中含量丰富，心脏和骨骼肌中也有表达，其基因定位于(1q25)，与NMNAT-1的基因序列同一性仅为34%～35%，但也含有四个氨基酸组成的无序羧基端。它共拥有307个氨基酸残基，内部含有由三个外显子编码的亚型特异性序列：赖氨酸107—亮氨酸192。其整体氨基酸序列根据功能结构不同大致可分四个区域：喜入区：232个氨基酸残基；准入区：29个氨基酸残基；易入区：1个氨基酸残基；禁入区：2个氨基酸残基。NMNAT-2是亚单位分子量为34千道尔顿的二聚体结构。其性质不稳定，易于氧化，在神经细胞内半衰期<2 h。因为其表面形成一种亚型特异性“外衣”，所以易被棕榈酰化并贴附于高尔基复合体。

人NMNAT-3是一种同源四聚体结构，分子量28 kD，含有252个氨基酸残基，内部亚型特异性序列为亮氨酸105—丙氨酸125，无序羧基端与前两者相同，其N端的氨基酸序列决定了其线粒体定位。NMNAT-3的表达形式与NMNAT-2几乎不重叠，含量明显少于NMNAT-1。人体肺脏、脾脏、红细胞中都有NMNAT-3的表达，在胎盘及肾脏中也有小范围的组织分布〔1～4〕。

2 NMNAT的生物作用

2.1NMNAT的NAD合成活性 NAD是生物体内重要的携电子体和信号通路中的重要分子，它是生物体内氧化还原反应的重要辅酶，这早已被人们所熟知。但其在生物体内所发挥的作用还远不止这一种。人体内许多NAD消耗酶都要以其为底物，例如：ADP核糖转移酶、ADP核糖聚合酶、cADP核糖聚合酶以及去乙酰化酶等。早已有研究证明，NAD除在氧化磷酸化和氧化还原反应中发挥其经典作用外，还在基因转录、生命延长及细胞死亡过程中起调节作用，更在糖代谢及生理节律的控制中发挥调节功能〔5,6〕。NMNAT是体内NAD生物合成过程中的关键酶，对于维持体内NAD水平至关重要。原核生物和一些低级别的真核生物体内的NAD是由烟酸经从头合成途径合成，而哺乳动物体内NAD主要经补救合成途径合成，而且其前体并不是烟酸，而是烟酰胺(NAM)。NAM在体内烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)的催化下生成烟酰胺单核苷酸(NMN)，后者经NMNAT催化并在ATP的参与下生成NAD，同时帮助其维持稳态。此反应为可逆反应且平衡常数接近于1，但现在认为在体内此反应趋向于向前发生。生理情况下此可逆反应会因缺乏焦磷酸(PPi)而受到抑制〔2〕。在催化过程中，三种不同的NMNAT亚型也具有不同的催化特性。在与NMN反应之前，ATP要先与细胞核中的NMNAT-1或高尔基体中的NMNAT-2相绑定，但线粒体中NMNAT-3所催化的反应顺序却正好相反，而且NMNAT-3利用ATP的效率更高。在反应速度方面，NMNAT-1和NMNAT-3的催化速率相似，NMNAT-2相对较慢。

2.2NMNAT：一种新的分子伴侣 分子伴侣是一类有助于多种蛋白复合装配、蛋白折叠以及蛋白损伤后再折叠的蛋白质。NMNAT有独立于其酶促反应之外的分子伴侣功能。它可以在蛋白折叠过程中与APT相耦联。如果去掉其羧基端，包括与ATP的绑定位置，则分子伴侣功能失效而NAD合成活性不变。通过对果蝇NMNAT(dNMNAT)的研究，科学家发现它可以使非本体的蛋白质构造更加稳固，还可以促使错误折叠的蛋白质降级或正确折叠。无论是野生型还是无活性的dNMNAT都可以在热休克导致的蛋白质变性中保护荧光素酶，从而在蛋白质结构恢复过程中使热变性的荧光素酶适当的再折叠，发挥与热休克蛋白70(HSP70)，HSP40以及HSP16.2相类似的作用。另外，重组dNMNAT可以在热变性中保护柠檬酸合酶。NMNATs还可以减少蛋白聚合。在酵母菌蛋白研究模型中，NMNAT-1和NMNAT-2通过清理毒性蛋白减少了α突触核蛋白—多聚谷氨酰胺介导的蛋白水解应激〔7〕。NMNAT还是一种新型应激反应蛋白。dNMNAT的过表达能够增加氧化应激时果蝇的耐热性，从而延长果蝇寿命。在活体试验中，热休克因子(HSF)与编码NMNAT基因的启动子相绑定，诱导热休克条件下NMNAT的表达。相反，在缺氧条件下，缺氧诱导因子1α(HIF1α)在HSF的介导下可直接上调NMNAT〔8〕。

2.3NMNATs的基因调控功能 近年来，NMNATs的基因调控功能也愈加被人们所重视。科学家Zhang等发现哺乳动物细胞核内NMNAT-1作为基因调节因子在PARP-1和SIRT1的介导下可以调节目的基因的表达，例如ATXN10和NAT1，这些基因调控作用大多依赖NMNAT所催化的NAD合成；而也有一些基因的调控依赖于SIRT1的募集作用，SIRT1将NMNAT-1募集到目的基因的启动子，调控其转录过程〔7〕。

2.4年龄相关的滔蛋白病变与NMNAT 滔蛋白病变是一种与年龄密切相关的中枢神经系统疾病，以滔蛋白的异常磷酸化和过度聚合为特点。随着年龄的增长，滔蛋白在中枢神经系统的过度表达会引发大脑皮质神经细胞内空泡的形成和神经纤维变性，导致年龄相关的自发性活动的减少以及严重的学习和记忆功能障碍，甚至引发痴呆(阿尔茨海默病)。Yousuf等科学家曾以果蝇为实验模型，发现中枢神经系统NMNAT水平是学习和记忆功能障碍发生年龄的重要决定因素，中枢神经系统NMNAT水平的降低会导致学习和记忆功能障碍发病年龄的提前。在滔蛋白病变模型中，中枢神经系统中NMNAT的过表达可以明显改善年龄相关的学习和记忆功能缺陷。

3 NMNAT与糖代谢

3.1胰腺内NMNAT的表达 2004年美国科学家Yalowitz等成功克隆出人NMNAT的cDNA，并利用其指导合成了人NMNAT-2，确认人NMNAT的cDNA含有92个碱基对并指导合成了这个拥有307个氨基酸的多肽链，也提出尽管人NMNAT-2与人NMNAT-1仅有34%～35%的氨基酸序列同一性，但其酶活性却与NMNAT-1相似。由于NAD的消耗会引起ATP池和GTP池当中ATP和GTP含量下降，并由此导致胰岛β细胞损害引发胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)〔9〕，于是人工合成了人NMNAT-2唯一的表面抗原决定簇抗体，并在对正常成人胰腺取材进行免疫组化分析后惊异的发现，胰腺外分泌细胞当中NMNAT-2蛋白表达很少，而人胰岛细胞上却有明显的NMNAT-2蛋白表达。虽然他们认为NMNAT-2在胰岛β细胞内的表达应与其相似，但还不能将此表达直接定位于胰岛β细胞，此后从胰岛素瘤病人的胰腺组织中提取出可以分泌胰岛素的肿瘤细胞，并确认了其中NMNAT-2的高表达；而且因为胰岛β细胞对于NAD的消耗非常敏感，NMNAT-2的高表达会增加胰岛β细胞的生存概率。这些都佐证了NMNAT-2在人胰岛β细胞中的表达应与胰岛其他细胞相一致〔10〕。

NAMPT为人们所熟知是以其另外一个身份：内脂素(visfatin)，它是内脏脂肪组织分泌的脂肪因子，是连接脂肪组织、炎症和免疫的纽带。其后人们又发现其蛋白结构与前B细胞克隆因子蛋白结构一致，而现在又已证实visfatin和NAMPT确为同一物质。因此，NAMPT现也被称为visfatin/PBEF/NAMPT〔11〕。NAMPT位于NAD生物合成途径的上游，其作用是催化NAM生成NMN。Karen等用qRT-PCR方法评估了人胰岛组织当中NAMPT的基因水平，并用免疫荧光/共焦成像法测定了其在胰岛组织中的表达，同时也阐述了葡萄糖对于人胰岛β细胞当中NAMPT的表达、分泌和调节的影响。这也从某种程度上与NMNAT在胰岛β细胞当中的表达相契合〔12〕。

3.2NMNAT与SIRT1 SIRT1是去乙酰化酶(Sirtuins)家族当中七个成员(SIRT1-7)之一，是NAD依赖的脱乙酰酶类，其对于糖脂代谢的重要作用广为人知〔13～15〕：它不仅能够促进哺乳动物的脂肪代谢和脂肪酸氧化，而且其活性的改变还参与了衰老和肝脏脂肪变性等病理生理过程。最近有研究表明，SIRT1不仅可以抵抗氧化应激和炎症给胰岛β细胞带来的损害，其对于代谢紊乱和衰老情况下胰岛β细胞功能紊乱的调节也至关重要。为了证明定位于细胞核内的人NMNAT-1是NMNAT家族中负责调解SIRT1的关键酶，科学家Zhang等以 WldS 小鼠为模型研究发现细胞核内部NAD对SIRT1有调节作用。细胞Sir2和SIRT1的功能依赖于其脱乙酰酶活性，而这一活性需要NMNAT所催化的NAD辅助。NAM既是NAD补救合成途径中NAD的前体，也是利用Sirtuins 和PARP-1且依赖NAD的蛋白修饰作用的副产物，它可以抑制Sir2和SIRT1 的活性。与此同时，在研究哺乳动物细胞核内SIRT1的控制作用时，人们已着眼于NAMPT和NMNAT-1这两种NAD补救合成途径当中的重要合成酶，他们利用NAM的消除和NAD的生成调节SIRT1活性〔16〕。一项在乳腺癌细胞上分别进行的NAMPT和NMNAT-1基因敲除实验显示，敲除后细胞内下降的NAD水平改变了基因表达的总体模式，而且SIRT1会与那些通常受NAMPT和NMNAT-1调节的基因启动子相绑定，SIRT1和SIRT1组蛋白脱乙酰酶的活性也在这些启动子上受到NAMPT和NMNAT-1调节〔17,18〕。

3.3SIRT1对胰岛素分泌的影响 一项基于胰岛β细胞特异性SIRT1过表达转基因小鼠(BESTO小鼠)的研究显示：SIRT1对于胰岛β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)有阳性调节作用，增加胰岛β细胞中SIRT1的含量可以明显增强GSIS，并可改善BESTO转基因小鼠的糖耐量。甚至在长达30 w的高脂饮食诱发的糖尿病条件下，仍可以增强GSIS。相反，SIRT1缺乏的小鼠模型则表现出GSIS功能下降，这进一步说明了SIRT1对于胰岛β细胞GSIS功能调节的重要性〔19〕。Kathryn Moynihan Ramsey等在衰老的雄性BESTO小鼠模型上发现，西式的高脂饮食导致的体重增加和单一血脂增高都不足以消除SIRT1给胰岛β细胞带来的益处〔20〕。针对SIRT1调节胰岛素分泌的机制，Bordone等科学家进行了深入的研究，他们发现UCP2可以引发葡萄糖刺激的胰岛素分泌缺陷。UCP2的上调与细胞在受到葡萄糖刺激后无法增加ATP水平有关。而UCP2基因的敲除则可以使SIRT1水平较低的胰岛β细胞恢复分泌胰岛素的能力。最后经实验证实：SIRT1正是通过与UCP2启动子直接绑定来抑制UCP2，增加胰岛素分泌，这一过程调节了葡萄糖生成ATP的解耦联，而增高的ATP水平触发了胰岛β细胞膜去极化及钙离子依赖的泡吐作用〔21,22〕。另有研究显示：SIRT1可以分别通过FOXO1和核转录因子(NF-Κb)的p65亚单元的去乙酰化对代谢应激和细胞因子介导的胰岛β细胞死亡起保护作用〔19〕。最近也有学者认为，受NMNAT调节的NAD合成以及其依赖于SIRT1的促胰岛素分泌机制有可能也参与了胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)的促胰岛素分泌过程。

3.4SIRT1对胰岛素敏感性的影响 已有确凿的证据证明在限制能量摄入(CR)的条件下，SIRT1介导的STAT3的去乙酰化作用不仅可以增加骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取，还能增强胰岛素刺激的PI3-K信号。肝脏SIRT1的缺乏会损伤PPARα的功能，降低脂肪酸的β氧化，在高脂饮食条件下引发肝脏脂肪变性、炎症反应和内质网应激〔23〕。在正常膳食情况下，肝脏SIRT1的缺乏会损伤哺乳动物mTORC2/AKT信号通路的作用靶点，引发慢性高血糖症、氧化应激以及全身性胰岛素抵抗〔24〕。在脂肪组织中，脂肪组织特异的SIRT1缺如会导致肥胖加重，使衰老和高脂饮食引发的糖尿病模型加重胰岛素抵抗〔25〕。最近有研究发现，SIRT1可以促进PPARγ对Prdm16的募集作用和PPARγ去乙酰化共同介导的白色脂肪组织的“棕色脂肪化”，进而改善胰岛素敏感性〔26〕。

NMN是NMNAT介导的NAD生物合成途径的中间产物，也是NAD的前体。Yoshino等科学家通过以糖尿病小鼠肝脏组织为模型的实验，证实了NMN可以增加胰岛素信号通路中AKT的磷酸化水平，进而改善胰岛素敏感性〔27〕，还可以通过下调诸多胰岛素抵抗相关基因的表达，如NF-ΚB、Lipin1、Pbk4等，从而改善胰岛素抵抗。在这一调节过程中，SIRT1正是重要的中间环节之一〔28,29〕。

综上所述，NMNATs作为生物体内重要的管家酶，其在氧化还原反应当中的重要地位毋庸置疑。依赖于NMNAT所维持的生物体内NAD水平，SIRT1的活性对胰岛素分泌，胰岛素抵抗等诸多方面发挥着重要作用。近年来，更有学者提出了“NAD WORLD”的概念〔30〕，其中包含了NAD依赖的SIRT1活性的改变、NAMPT-NMNAT所调节的NAD及其中间产物(NMN)的生物合成，它们共同组成了一个复杂的调节网络，涵盖了代谢与衰老的生理病理过程，调节方式，影响因素，治疗靶点等多个领域。相信其无论在基础研究还是在临床预防治疗方面都有无限的发展前景。

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