关节软骨组织体外保存力学环境构建

门 蒙 亓建洪

(泰山医学院运动医学研究所，山东 泰安 271000)

目前多种治疗方法运用于关节软骨缺损的修复，但大多数疗效不理想，修复组织也以纤维软骨为多，缺乏正常透明软骨的生物力学性能及耐用性。 同种异体骨软骨移植术是将供体关节的活性骨软骨块移植到受体关节软骨及软骨下骨缺损区，以修复关节软骨损伤〔1,2〕。患者软骨缺损区完全被透明软骨修复；关节软骨细胞完全包埋在周围软骨基质中，为“免疫豁免”组织。关节软骨是一种特殊的结缔组织，表面光滑位于骨两端关节面位置，在骨与骨间的关节处为其活动提供低磨损和摩擦的光滑界面，起着缓冲运动震荡，传递载荷等不可替代的作用。关节软骨内无血管、淋巴管及神经组织，组织代谢活性较低，营养全部来自关节液，基本无自身修复能力〔1,2〕。异体软骨移植材料来源充足，不需要二次手术获取移植物而受到患者欢迎。尽管同种异体软骨是目前治疗软骨缺损较有效的治疗手段，但实际操作过程中仍存在一些问题。同种异体骨软骨移植中重要的问题是移植物的保存。体外保持软骨细胞正常活性，延缓细胞凋亡，促使其分泌软骨基质，保持软骨组织正常活性及形态。因此,延长移植物的保存时间是同种异体软骨移植的关键。目前，体外培养保存活性关节软骨组织的最长时间为3 w，远不能满足临床需要。限制软骨体外保存的主要因素：化学因素及物理因素。化学因素包括温度、pH值、CO2、保存液成分。物理因素主要为力学环境。软骨体外保存均为静态液体保存，缺少物理因素干预。如何在体外构建模拟人体的力学环境，延缓体外保存软骨细胞的凋亡率，保持软骨细胞生物活性从而延长保存时间是研究探索的重点。

1 关节软骨体外力学环境

成人关节骨软骨自关节面向深部可分为透明软骨层、钙化软骨层和软骨下骨三层结构。透明软骨主要由软骨细胞和Ⅱ型胶原蛋白与蛋白多糖等细胞外基质(ECM)组成；钙化软骨层主要由少量肥大软骨细胞和Ⅱ型胶原蛋白与羟基磷灰石等ECM组成；软骨下骨主要由成骨细胞和Ⅰ型胶原蛋白与羟基磷灰石等ECM组成。关节骨软骨的这种特殊结构组成及其界面连接方式，不但有利于各层组织利用各自的生理微环境进行新陈代谢，而且有利于其生物力学功能的发挥。ECM包括胶原和蛋白聚糖,其中软骨细胞所特有分泌的胶原Ⅱ型胶原占胶原总量的九成, Ⅱ型胶原保障关节软骨的抗张力强度,软骨细胞活性降低导致Ⅱ型胶原分泌量下降，从而软骨组织力学性能的减弱〔3〕。在对软骨细胞培养过程中发现显示动态压力(DC)刺激可维持Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成〔4〕。软骨细胞在人体内处于封闭力学环境中，根据模拟关节真实运动，软骨细胞对压应力、张力、剪切力均敏感〔5，6〕。力学载荷促使软骨细胞的正常功能和ECM正常表达的稳定。

关节软骨由软骨基质及软骨细胞组成,软骨细胞仅占软骨体积的1%～5%,但合成ECM,并调节基质的代谢，体外研究实验多采用的压力方式有两种：DC、静态压力(SC)。软骨组织块在SC下处于压缩状态，导致软骨细胞代谢能力的下降，细胞活性的衰落，抑制组织合成与代谢。目前国内外研究软骨体外保存培养实验中均静态或SC，实验过程中关节软骨处在制动状态，缺乏应力负荷刺激，使关节软骨内蛋白聚糖含量下降，关节软骨内水和电解质平衡紊乱细胞分解代谢加强，导致软骨基质纤维化。在对大鼠模型膝关节屈曲固定制动不同时间的研究证实了持续制动会导致软骨生物力学性能的下降，导致关节疾病的发生〔7〕。根据动物实验发现压缩力可以刺激软骨细胞的分化与代谢。而在对压缩力性质试验中发现动态压力刺激的效果更明显〔8～10〕。关节软骨日常活动时产生的即是动态压缩力，与关节日常功能一致，是软骨在体内受到的主要作用力〔11〕。DC的其他作用主要有以下几个：①可维持细胞正常的渗透压，减少细胞膜渗透性；②可在早期干预关节炎的发生发展；③有助于软骨细胞保持正常形态；④有利于超微结构的恢复；同时在细胞新陈代谢中的作用无可比拟〔12〕。

膝关节在股骨远端与胫骨近端起到支撑、运动的作用,关节囊内有滑液,起到营养软骨和润滑软骨表面。股骨髁、半月板、胫骨平台相互接触,产生相对运动,一种是滚动,另一种是滑动〔13〕，一种可以想象成擀面杖压面皮，一种为汽车车轮的滑动，由此两种合力产生的对关节软骨的表面剪切力。孙明林等〔14〕进一步研究了在不同压缩强度下获得的组织工程软骨性能，发现在0.4 Hz、20%压缩强度、3 h滚压时间的滚压参数下，干细胞能更好地向软骨细胞分化以及维持软骨细胞表型。人正常行走膝关节运动是由滚动和滑动共同构成的,滚动约占60%,滑动约占40%;滚动速度为0～15 cm/s,滑动速度为0～35 cm/s〔15〕。

2 生物反应器

生物反应器的目的是为体外培养构建提供合适的生物环境,通过组织工程培养获得与人体组织相似的结构与功能〔16〕，化学条件温度以及CO2的控制可在细胞孵化箱内调节，pH值的控制也可调节，对于物理因素的调节仍在探索中。用于软骨培养的生物反应器种类较多，由于目前没有一个确定的结论，所以各反应器施加的力不尽相同：流体剪应力、液体压力、拉伸、直接压缩、变形剪应力或其中力的组合〔17〕。目前仍没有一种较为理想的生物反应器。生物反应器及生物体外保存装置的要求：装置充分模拟人体生物环境，使营养物质与代谢产物有效循环利用，使得装置中的pH值、液体浓度、CO2含量等维持稳定；能保证培养物内部信号分子、营养和废物的有效运输，能施加有效力学刺激弥补体外培养的不足，但要保证施加力学刺激不会对细胞产生破坏及损伤，尽最大可能模仿体内真实力学刺激环境。从功能上来看，组织工程反应器与软骨体外培养生物反应器基本一致，都是提供与人体相似的生物环境与力学环境。软骨保存反应器的力学环境是为了抑制细胞凋亡，将细胞生存率保持在一个较高水平。目前国内外多为组织工程生物反应器的研究探索，实验对象均为软骨细胞或干细胞诱导软骨细胞，尚没有完整的针对软骨组织块的生物反应器。在对体外软骨组织块力学保存上没有一个完善的标准，存在较多争议，原因是多方面的：由于个体的差异及软骨所处内环境的复杂性，难以有一个统一的生物学标准;物理因素对体外培养产生的影响未引起足够认识，在生物反应器中其生物和物理参数根据环境的不同而改变，随着临床需要的加大，组织工程研究的深入、机械控制技术以及生物材料应用的提高，可实现对生物反应器生物环境的精确控制，选择最佳生物参数，建立体外培养即时控制反馈系统〔18〕。在保存液技术较为成熟的情况下，软骨体外保存反应器将成为软骨体外保存的研究趋势。

3 总结与展望

同种异体软骨移植技术经临床实验及长期跟踪随访被证实为有效的治疗关节损伤疾病的方法。随着保存液技术的不断发展，软骨的保存时间得到有效延长。从软骨培养的生物反应器的发展看,软骨细胞对很多物理因素都有响应,而力学因素的影响占重要位置。软骨的体外培养中,若能施加力学刺激能提高软骨细胞的成活率。要探索得到合适的力学条件,按照组织工程仿生的原理,还需研究关节的自然运动。

4 参考文献

1卫小春.关节软骨〔M〕.北京:科学出版社,2007:1-83.

2Bae JY, Matsumura K, Wakitani S,etal.Beneficial storage effects of epigallocatechin-3-o-gallate on the articular cartilage of rabbit osteochondral allografts〔J〕.Cell Transplant,2009;18(5):505-12.

3Malinin T,Temple HT,Buck BE.Transplantation of osteochondral allografts after cold storage〔J〕.J Bone Joint Surg Am,2006;88(4):762-70.

4Wright MO,Nishida K, Bavington C,etal.Hyperpolarisation of cultured human Chondroeytes following cyclieal pressure-induced strain:evidence of a role for Alpha 5 beta 1 integrin as a chondrocyte mechanoreceptor〔J〕.Orthop Res,1997:15(5):742-7.

5顾 延,戴克戎,裘世静,等.应力降低导致关节软骨退变机理的形态学研究〔J〕.中华骨科杂志,1995;15(9):631-3.

6Shiu YT,Li S,Yuan S,etal.Shear stress-induced-fos activation is mediated By rho in a calcium-dependent manner〔J〕.Biochem Biophys Res Comm,2003;303(2):548-55.

7Hagiwara Y,Ando A,Chimoto E.Changes of articular cartilage after immobilization in a rat knee contracture model〔J〕.J Orthop Res，2009;27(2):236-42.

8Haugh MG, Meyer EG, Thorpe SD.Temporal and spatial changes in cartilage-matrix speciic gene expression in mesenchymal stem cells in response to dynamic compression〔J〕.Tissue Eng Part A,2011;17(23-24):3085-93.

9Schätti O,Grad S,Goldhahn J.A combination of shear and dynamic compression leads to mechanically induced chondrogenesis of human mesenchymal stem cells〔J〕.Eur Cell Mater,2011;22:214-25.

10沈士浩，李雪萍.应力负荷与关节软骨损伤〔J〕.中国康复医学杂志，2013；28(5)：475-8.

11亓建洪,王 伟,吴雅迪,等.人异体骨软骨移植物保存方法研究〔J〕.中国矫形外科杂志,2012;20(1):64-7.

12Jackson DW, Whelan J, Simon TM.Cell survival after transplantation of fresh meniscal allografts.DNA probe analysis in a goat model〔J〕.Am J Sports Med,1993;21 (4):540-50.

13陈启明,梁国穗,秦 岭,等.骨科基础科学-骨关节肌肉系统生物学和生物力学〔M〕.北京：人民卫生出版社,2003：420-80.

14孙明林,朱 雷,吕 丹,等.不同参数滚压模式对兔BMSCs向软骨细胞分化促进作用的研究〔J〕.中国修复重建外科杂志,2013;27(1):89-94.

15Guilak F,Butler DL, Goldstein SA,etal.Functional tissue engineering〔M〕.Berlin:Springer-Verlag,2004:332-400.

16樊瑜波，陶祖莱.组织工程生物反应器的生物力学 〔J〕.医用生物力学,2005;20(4):203.

17张春秋，孙明林，李 江，等.节软骨体外构建力学环境的研究进展 〔J〕.医用生物力学,2009;24(6)：462-7.

18王 华.剪切力对体外培养人软骨细胞代谢的影响〔D〕.武汉：武汉大学,2011.