组蛋白去乙酰化酶：缺血性脑卒中治疗的潜在新靶点

傅淑平 卢圣锋 沈卫星 景欣悦 朱冰梅

(南京中医药大学第二临床医学院针药结合省部共建教育部重点实验室，江苏 南京 210023)

缺血性脑卒中病理生理机制主要包括以神经细胞死亡、炎症发生、血脑屏障破坏等组织损伤为特征的急性期和以神经血管恢复为特征的后期，目前缺乏有效的治疗药物〔1〕。以往研究〔2〕显示仅仅针对脑卒中病理生理机制中单一环节的药物，即使在动物模型中可以有较好的效应，均无法在临床实验中取得相应的疗效。目前认为，只有作用于脑卒中发生发展的多个病理环节并发挥强大神经保护作用的药物才有可能成为有效的脑卒中治疗新药〔2〕。越来越多的研究表明表观遗传学机制如DNA甲基化、组蛋白修饰等在多种生物学过程中扮演着重要的角色；其中组蛋白乙酰化在神经系统的发育、成熟及损伤修复中具有重要地位〔3～7〕。本文主要从组蛋白去乙酰化酶(HDACs)在大脑发育中的重要作用及HDACs抑制剂多靶点抗脑损伤，促进受损脑组织形态及功能恢复等方面进行综述。

1 组蛋白乙酰化修饰与HDACs

1.1组蛋白乙酰化修饰 组蛋白乙酰化是一个重要的翻译后修饰，它所引起的染色质结构重塑是基因表观转录调控的重要机制。组蛋白乙酰化修饰主要由两个作用相反的酶调控，即组蛋白乙酰转移酶(HATs)和HDACs。HATs将乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白氨基末端特定的赖氨酸残基上，有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因的转录；HDACs与辅助抑制因子形成共阻遏复合物，由转录抑制因子将其募集到特定的基因启动子区，使组蛋白去乙酰化，与带负电荷的DNA紧密结合，致使染色质致密卷曲，抑制基因的转录〔8〕。生理情况下，HATs与HDACs的功能处于一个动态平衡过程中，调控组蛋白乙酰化修饰，以保证基因在时间及空间上的有序表达，从而确保机体的各种功能平衡。

1.2HDACs及HDACs抑制剂的分类 自1996年鉴定出HDAC1之后，到目前为止，人们已确认在哺乳动物中一共有18种HDACs，根据其与酵母HDAC的同源性分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ类；其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ类为锌离子(Zn2+)依赖型，共11种。Ⅰ类为酵母还原性钾离子依赖蛋白(Rpd)3同源物，包括HDAC1、2、3和8，主要位于胞核，调节组蛋白乙酰化；Ⅱ类又分为Ⅱa、Ⅱb两个亚型，为酵母HDA1同源物，可调控组蛋白和非组蛋白乙酰化修饰，其中Ⅱa类包括HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9，主要作为转录辅阻遏物穿梭于细胞核与细胞质之间；Ⅱb类含HDAC6和HDAC10，主要位于胞质；Ⅳ类，HDAC11，含有Ⅰ、Ⅱ类的两种催化位点，主要位于胞核，具体功能尚不清楚。Ⅲ类，又称Sir2样去乙酰化酶或者Sirtuin，为NAD+依赖型，共7种；沉默调节蛋白(SIRT)3、SIRT4及SIRT5位于线粒体中，而其余SIRTs位于胞质中，与细胞衰老及能量代谢相关〔9〕。

现有的HDACs 抑制剂按结构主要分为六类：①短链脂肪酸类，如丙戊酸(VPA)、丁酸等；②异羟肟酸(小分子氧肟酸类)：如辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、曲古菌素A(TSA)等；③苯甲酰胺类，如MS-275，CI-944等；④含环氧酮结构的环四肽类，如Trapoxin A和Trapoxin B；⑤不含环氧酮结构的环四肽类，如缩酚酸肽(FK228)和Apicidin；⑥杂环化合物类，如CHAP31、CHAP50。 这些抑制剂主要是通过竞争性地与HDAC上的Zn2+结合，使之无法与乙酰基上的氧的水合物螯合，从而发挥抑制HDAC活性的作用。因此它们主要作用于Zn2+依赖型HDACs，其中异羟肟酸类可作用于Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ类HDACs，短链脂肪酸类可抑制Ⅰ、Ⅱ类HDACs活性，余下四类则主要抑制Ⅰ类HDACs活性；而各类HDACs对相应抑制剂的敏感性也存在着不同的差异。由于Sirtuins为NAD+依赖型，因此他们对这些HDACs抑制剂并不敏感，但其活性可被烟酰胺、Sirtinol等抑制〔9，10〕。

2 HDACs与缺血性脑卒中的关系

2.1HDACs在大脑发育中的作用 就HDACs去乙酰化作用而言，HDACs除了以组蛋白为去乙酰化底物，调节相关基因转录活性外，还可以通过催化一些非组蛋白如转录因子〔p53、E2F1、核因子(NF)-κB〕、细胞骨架蛋白、热休克蛋白(Hsp)90、Hsp70等分子伴侣和NF等，降低其乙酰化水平，参与对细胞基本活动的调节，如细胞周期、细胞增殖、存活、分化、代谢及蛋白转运、DNA修复和血管发生等；HDACs功能的异常可导致组蛋白乙酰化水平的异常，从而导致多种疾病的发生〔11〕。大量研究显示，HDACs在神经系统的发育中具有重要作用，是神经细胞分化、存活及成熟的重要调节者。

研究表明，HDAC1～11在脑组织各部位如皮层、海马、嗅球、下丘脑等均有表达，其中HDAC11、HDAC3及HDAC5表达量最高，HDAC4与HDAC2次之，HDAC10、 HDAC9及HDAC7表达量最低；大部分HDACs在神经元细胞内均有表达，只有三种HDACs(HDAC2，5，11)在少突胶质细胞内有表达，而星形胶质细胞与血管内皮细胞内则无HDACs蛋白表达，这提示着HDACs可能是神经活动的调节者〔12，13〕。有研究者用斑马鱼对HDAC1遗传学功能进行分析，结果显示HDAC1是少突胶质细胞分化成熟所必需的；同时它通过调节Wnt与Notch信号通路，控制着运动神经元的形成，轴突的生长及神经元迁移；HDAC1的敲除可导致神经系统发育的致命缺陷〔14～17〕。而且HDAC1还被认为是神经细胞生与死的分子开关，研究表明HDAC1若被HDAC3募集结合形成复合物，会促使神经细胞走向死亡，HDAC1或HDCA3的失活均可有效阻断由HDAC1/3复合物所诱发的细胞损伤；若HDAC1与HDAC9的异构体HDACs相关蛋白(HDRP)形成复合物，则可降低c-jun启动子区H3乙酰化水平，抑制JNK/c-jun信号通路，促进细胞的存活〔18〕。实验研究还发现，HDAC1与HDAC2共同调控神经元细胞的发育与成熟，如若在小鼠胚胎发育过程中敲除HDAC1与HDAC2，胚胎鼠神经干细胞将无法发育为成熟的神经元，并会出现过度的细胞凋亡，从而导致出生后的小鼠海马结构出现异常，小脑叶缺失，皮层神经元无序分布，最终在出生后7 d内就死亡〔19〕。Ye等〔20〕进一步证实，具有转录协同抑制作用的HDAC1及HDAC2主要是通过与β-catenin竞争性结合TCF7L2，从而调控少突胶质细胞分化相关基因的表达，以促进神经分化。此外，HDAC2还参与神经电生理活动，在小鼠前额皮质部位过度表达HDAC2，可明显降低代谢型谷氨酸受体(mGlu)2的表达，减少皮质神经元电生理活动，从而影响神经冲动的传递〔21〕。

除了Ⅰ类HDACs外，一些Ⅱ类HDACs，如HDAC4、HDAC6、HDAC9也陆续被发现在大脑发育中具有重要地位。其中HDAC4是调控神经突触重塑及记忆形成的重要的蛋白，HDAC4在N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体的介导下穿梭于细胞核与细胞质之间，进入核内后，与肌细胞增强因子(MEF)2形成复合物，通过去乙酰化作用调控与神经突触形成相关的基因谱，影响突触结构的形成及其功能的发挥〔22〕；选择性敲除脑内HDAC4，将导致与海马结构异常相关的空间学习、记忆及长时程突触可塑性均会受到严重的损害〔23〕。HDAC6则主要参与大脑认知能力的形成，参与情绪稳定的调控，Fukada等〔24〕发现HDAC6基因敲除鼠与HDAC6特异性抑制剂处理的小鼠在行为测试中均表现出极度活跃、不焦虑、抗抑郁样行为，这可能与HDAC6可逆性调节5-羟色胺(5-HT)乙酰化水平，调控5-HT能神经元神经活性相关；但在急性应激状态下，沉默HDAC6基因或抑制HDAC6活性均可阻断应激诱发的谷氨酸能神经传递，减轻应激反应〔25〕。Sugo等〔26〕则在研究皮层神经元发育中发现，HDAC9在新生神经元成熟过程中，随着细胞自发性电活动的增强而由核内转移至核外，若阻断HDAC9向核质转运或促进其向核内转运，将阻碍神经元树突的形成和伸长；反之，若促使其向核外转运或直接抑制其表达将促进神经元树突的形成并生长形成神经网络，说明HDAC9是神经元成熟并形成神经网络的重要调控因子。以上结果均表明HDACs在中枢神经系统发育成熟过程中占有重要地位。

2.2HDACs与缺血性脑卒中 近年来大量研究发现，在多种脑缺血模型动物中，脑组织中组蛋白3乙酰化水平均明显降低，同时还有大量转录抑制因子在海马神经元核中异常聚集，多种HDACs在缺血性脑卒中发生过程中的表达水平也随着病情的发展而发生不同的改变〔13，27～30〕。Chen等〔13〕研究显示，缺血再灌注损伤可使HDAC1、HDAC2、HDAC5、HDAC9在术后48 h明显下降，HDAC3及HDAC6、HDAC11分别在术后24 h及3 h先出现明显上升，随后下降趋势；而选择性沉默HDAC3、HDAC6基因可显著减少缺血脑组织皮层神经元细胞凋亡率，提高细胞对缺氧的耐受性。说明缺血早期出现变化的HDAC3、HDAC6、HDAC11是参与神经细胞凋亡的重要因素；而在缺血晚期出现变化的HDAC1、HDAC2、HDAC5、HDAC9可能主要参与神经细胞的再生过程。最新的人类全基因组关联分析(GWAS)结果显示，对HDACs蛋白进行编码的HDAC9基因变异可显著提高脑卒中的发生概率，是与大血管脑卒中密切相关的基因区域〔31〕；进一步提示HDACs可能是脑卒中发生的关键环节。

3 HDACs抑制剂与缺血性脑卒中关系

HDACs抑制剂最初是作为抗肿瘤新药进入研究者的视野，目前已有几种HDACs抑制剂作为抗肿瘤药，进入Ⅰ或Ⅱ期临床，其中SAHA与FK228分别于2006、2009年获得了美国食品及药物管理局(FDA)批准用于治疗难治性皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)〔32〕。因此当研究者发现不同类型的缺血性脑卒中脑组织组蛋白乙酰化水平均明显下降，且有大量转录抑制因子在核内聚集时，许多研究团队将HDACs抑制剂引入缺血性脑脑卒中的防治领域并进行大量的研究，结果显示：HDACs抑制剂可维持甚至提高缺血脑组织组蛋白乙酰化水平；缩小脑梗死体积，降低细胞死亡率；促进缺血脑组织神经发生，降低神经功能缺损，促进损伤脑组织的再生修复〔19，27～30，33～37〕。其作用机制包括：①上调抗凋亡因子如Bcl-2、细胞周期依赖激酶抑制剂p21cip1/waf1表达，抑制促凋亡因子如Caspas-3、p53表达，从而发挥抗凋亡作用〔27，28〕。②抑制小胶质细胞和单核巨噬细胞活化，抑制促炎因子诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶(COX)2过表达；上调促生存因子Hsp70表达，稳定Hsp70-IkB-NF-κB，抑制NF-κB活性，降低基质金属蛋白酶(MMP)-9表达，发挥抗炎作用同时，减少血脑屏障通透性〔33，34〕。③降低内质网应激诱导的elF2a及C/EBP同源蛋白(CHOP)表达，减轻氧化应激损伤〔35〕。④增强星形胶质细胞摄取谷氨酸，抑制缺血诱发的兴奋性毒性〔36〕。⑤提高靶基因启动子区组蛋白4乙酰化水平，促进细胞周期依赖激酶抑制因子p15及神经元定向分化因子Ngn1，Math及NeuroD的表达；活化脑源性神经营养因子(BDNF)-TrKB信号通路，促进神经的发生〔19，37〕。整体来说，以HDACs为作用靶点的抑制剂可以作用于缺血性脑卒中多个病理环节，如兴奋性毒性、氧化应激、炎症反应、细胞凋亡及神经细胞再生等，发挥多靶点抗缺血性脑损伤的作用。

4 小 结

HDACs在大脑发育及成熟过程中占有重要的地位，并参与了缺血性脑损伤机制，是脑损伤发生发展中的一组重要蛋白，而HDACs抑制剂又可通过干预缺血性脑卒中多个病理环节，对缺血脑组织发挥出强大的多靶点保护作用；提示HDACs是一个极有潜力的治疗缺血性脑卒中的新靶点。但根据目前的研究成果，Zn2+依赖型HDACs一共有11种，而且各种不同亚型在脑内的分布、功能及不同部位的含量均不尽相同，有些HDACs的功能尚无相关报道，如HDAC11、HDAC10、HDAC7等，因此在以HDACs为靶点寻找设计治疗缺血性脑卒中的新药时，有以下几个问题需要予以重视：①作用靶点的问题：究竟是以某一个还是以某一类或者几类HDACs为作用靶点，才可以取得抗脑缺血损伤作用并可以成功地取得临床治疗效应;②给药剂量的问题：SAHA、FK228已经在临床上用于CTCL，其临床使用剂量是否对缺血性脑卒中患者同样适用;③给药时间问题：目前用于急性期对症治疗缺血性脑卒中的溶栓药物重组组织型纤溶酶原激活剂(rtPA)和尿激酶(UK)具有严格的时间窗(4.5 h内或6 h内)，那么HDAC抑制剂是否具有时间窗，其治疗持续时间应为多长，更重要的是它是否有可能成为脑卒中高危人群的预防用药。

5 参考文献

1Smith WS.Pathophysiology of focal cerebral ischemia：a therapeutic perspective〔J〕.J Vasc Interv Radiol,2004；15：S3-12.

2Langley B，Brochier C，Rivieccio MA.Targeting histone deacetylases as a multifaceted approach to treat the diverse outcomes of stroke〔J〕.Stroke,2009；40(8)：2899-905.

3Hsieh J，Gage FH.Chromatin remodeling in neural development and plasticity〔J〕.Curr Opin Cell Biol,2005；17：664-71.

4Copray S，Huyng JL，Sher F，etal.Epigenetic mechanisms facilitating oligodendrocyte development，maturation and aging〔J〕.Glia，2009；57：1579-87.

5Habeland M，Montgomery R，Olson EN.The many roles of histone deacetylases in development and physiology implications for disease and therapy〔J〕.Nature Rev，2009；10：32-40.

6Kao HY，Ordentlich P，Koyano-Nakagawa N，etal.A histone deaceylase corepressor complex regulates the notch signal transduction pathway〔J〕.Genes Dev，1998；12：2269-77.

7Shen S，Li J，Casaccia-Bonnefil P.Histone modifications affect timing of oligodendrocye progenitor differentiation in the developing rat brain〔J〕.J Cell Biol，2005；5：577-89.

8Sweatt JD.Experience-dependent epigenetic modications in the central nervous system〔J〕.Biol Psychiatry，2009；65:191-7.

9Xu K，Dai XL，Huang HC，etal.Targeting HDACs：a promising therapy for Alzheimer's disease〔J〕.Oxid Med Cell Longev,2011；2011：143269.

10程永浩，郭彦伸，韩海珠，等.新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂的合成及抗肿瘤活性研究〔J〕.药学学报，2010；45(6)：735-41.

11韩丽娟，徐 运.组蛋白去乙酰化酶抑制剂在缺血性卒中的神经保护机制〔J〕.国际脑血管病杂志，2012；18(5)：358-62.

12Broide RS，Redwine JM，Aftahi N，etal.Distribution of histone deacetylases 1-11 in the rat brain〔J〕.J Mol Neurosci,2007；31(1)：47-58.

13Chen YT，Zang XF，Pan J，etal.Expression patterns of histone deacetylases in experimental stroke and potential targets for neuroprotection〔J〕.Clin Expe Pharmacol Physiol，2012；39(6):751-8.

14Yamaguchi M，Tonou-Fujimori N，Komori A，etal.Histone deacetylase 1 regulates retinal neurogenesis in zebrafish by suppressing Wnt and Notch signaling pathways〔J〕.Development，2005；132：3027-43.

15Cunliffe VT.Histone deacetylase 1 is required to repress Notch target gene expression during zebrafish neurogenesis and to maintain the production of motoneurones in response to hedgehog signalling〔J〕.Development，2004；131：2983-95.

16Cunliffe VT，Casaccia-Bonnefil P.Histone deacetylase 1 is essential for oligodendrocyte specification in the zebrafish CNS〔J〕.Mech Dev,2006；123：24-30.

17Nambiar RM，Ignatius MS，Henion PD.Zebrafish colgate/hdac1 functions in the non-canonical Wnt pathway during axial extension and in Wnt-indepedent branchiomotor neuron migration〔J〕.Mech Dev,2007；124:682-98.

18Bardai FH，Price V，Zaayman M，etal.Histone deacetylase-1(HDAC1)is a molecular switch between neuronal survival and death〔J〕.J Biol Chem,2012；287(42)：35444-53.

19Kim HJ，Leeds P，Chuang DM.The HDAC inhibitor，sodium butyrate，stimulates neurogenesis in the ischemic brain〔J〕.J Neurochem,2009；110(4)：1226-40.

20Ye F，Chen Y，Hoang TN，etal.HDAC1 and HDAC2 regulate oligodendrocyte differentiation by disrupting the beta-catenin-TCF interaction〔J〕.Neuroscience，2009；12(7)：829-39.

21Kurita M，Holloway T，García-Bea A，etal.HDAC2 regulates atypical antipsychotic responses through the modulation of mGlu2 promoter activity〔J〕.Nat Neurosci,2012；15(9)：1245-54.

22Sando R 3rd，Gounko N，Pieraut S，etal.HDAC4 governs a transcriptional program essential for synaptic plasticity and memory〔J〕.Cell,2012；151(4)：821-34.

23Kim MS，Akhtar MW，Adachi M，etal.An essential role for histone deacetylase 4 in synaptic plasticity and memory formation〔J〕.J Neurosci,2012；32(32)：10879-86.

24Fukada M，Hanai A，Nakayama A，etal.Loss of deacetylation activity of Hdac6 affects emotional behavior in mice〔J〕.PLoS One,2012；7(2)：e30924.

25Lee JB，Wei J，Liu W，etal.Histone deacetylase 6 gates the synaptic action of acute stress in prefrontal cortex〔J〕.J Physiol,2012；590(Pt7)：1535-46.

26Sugo N，Oshiro H，Takemura M，etal.Nucleocytoplasmic translocation of HDAC9 regulates gene expression and dendritic growth in developing cortical neurons〔J〕.Eur J Neurosci，2010；31：1521-32.

27Yildirim F，Gertz K，Kronenberg G，etal.Inhibition of histone deacetylation protects wildtype gelsolin-deficient mice from ischemia brain injury〔J〕.Exp Netrol，2008；10：531-42.

28Kim HJ，Rowe M，Ren M，etal.Histone deacetylase inhibitors exhibit anti-inflammatory and neuroprotective effects at rat permanent ischemic model of stroke：multiple mechanisms of action〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2007；321：892-901.

29Gibson CL,Murphy SP.Benefits of histone deacetylase inhibitors for acute brain injury：a systematic review of animal studies〔J〕.J Neurochem,2010；115：806-13.

30Bal S，Bachleda AS，Morrison R，etal.Expression of histone deacetylases in cellular compartments of the mouse brain and the effects of ischemia〔J〕.Transl Stroke Res,2011；2：411-23.

31International Stroke Genetics Consortium(ISGC)and Wellcome Trust Case ControlConsortium 2(WTCCC2).Genome-wide association study identifies a variant in HDAC9 associated with large vessel ischemia stroke〔J〕.Nat Genet,2012；44(3)：328-33.

32Shabason JE，Tofilon PJ，Camphausem K.HDAC inhibitors in cancer care〔J〕.Oncology(Williston Park)，2010；24(2)：180-5.

33Zheng Z，Kim JY，Ma H，etal.Anti-imflammatory effects of the 70kDa heat shock protein in experimental stroke〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2008；28：53-63.

34Wang Z，Leng Y，Tsai LK，etal.Valproic acid attenuates blood-brain barrier disruption in a rat model of transient focal cerebral ischemia the roles of HDAC and MMP-9 inhibition〔J〕.J Cerebral Blood Flow Metabolism，2011；31：52-7.

35Qi X，Hosoi T，Okuma Y，etal.Sodium 4-phenylbutyrate protects against cerebral ischemic injury〔J〕.Mol Pharmacol,2004；66：899-908.

36Wu JY，Niu FN，Huang R，etal.Enhancement of glutamate uptake in 1-methyl-4-phenylpyridinium-treated astrocytes by trichostatin A〔J〕.Neuroreport,2008；19：1209-12.

37Yu IT，Park JY，Kim SH，etal.Valproic acid promotes neuronal differentiation by induction of proneural factors in association with H4 acetylation〔J〕.Neuropharmacologly，2009；56：473-80.