金铁锁活性成分基因调控网络及其产物评价研究进展

云南中医学院，云南 昆明 650500

金铁锁活性成分基因调控网络及其产物评价研究进展

江舟钱子刚

云南中医学院，云南 昆明 650500

对西南特有植物金铁锁的活性成分基因调控网络及其产物评价的研究进展进行了综述，为金铁锁植物代谢途径生物工程的应用,研究和开发提供一定的理论依据。

金铁锁；三萜皂苷；生物合成；调控；评价

金铁锁(PsammosilenetunicoidesW. C. Wu et C.Y.Wu)为石竹科(Caryophllaceae)金铁锁属(Pasmmosilene)植物[1]。主要分布于云南、四川、贵州等西南地区，是该地区特有的传统药用植物，是誉为“伤科圣药”的云南白药的主要组成药材之一。

金铁锁又名独丁子、独定子、金丝矮陀陀、昆明沙参、白马分鬃、独鹿角姜、百步穿杨、穿石甲、蜈蚣七(云南)[2]，首载于《滇南本草》，谓其：“味辛，辣，性大温，有小毒，吃之令人多吐。专治面寒痛，胃气心气疼，攻疮痈排脓”[3]。长期以来作为商品的药材全部依靠野生采挖，而金铁锁自然生长较缓慢，在经济利益驱使下采挖力度加大，使得野生资源迅速减少，现已作为稀有濒危物种被列入《中国植物红皮书》[4]。金铁锁野生资源已不能满足日益增长的中成药生产需求，而金铁锁五环三萜皂苷结构复杂，天然资源来源有限，利用生物技术从分子水平上对金铁锁皂苷合成的关键基因进行调控，促进关键酶表达，提高五环三萜皂苷的产量构建基因调控网络并进行产物评价研究已渐成趋势，现就金铁锁活性成分基因调控网络及其产物评价研究概况综述如下。

1 五环三萜皂苷基因调控网络

1.1 齐墩果烷型五环三帖的合成 自从“活体的异戊二烯法”被提出后，IPP和DAMPP被公认为是萜类化合物的前体，其中甲羟戊酸(Mevalonic acid)生成的异戊烯基焦磷酸IPP(Isopentenyl Diphosphate)是“活化”的异戊二烯单元，在烯丙基转移酶(Prenyltransferase)的催化作用下[5]，与其烯丙基异构体DMAPP经头尾缩合生成香叶基焦磷酸(Geranyl diphosphate，GPP)，二磷酸合成酶(FPS)的催化作用下，GPP加上第二个IPP单元形成法呢基焦磷酸(Farnesyl diphosphate，FPP)，两分子的FPP在鲨烯合酶(Squalene synthase，SS)催化作用下“头对头”缩合连接形成三萜鲨烯[6]，黄素蛋白在O2和NADPH等辅助因子的参与下催化鲨烯生成2,3-氧化鲨烯(Squalene-2,3-oxide)，2,3-氧化鲨烯在2,3-氧化鲨烯环化酶(Oxidosqualene cyclase OSCs)的催化下，形成三萜皂苷元骨架[7-8]。整个三萜皂苷生物合成的关键酶属于一个超家族，由催化甾体生物合成的环阿屯醇合成酶和催化各种三萜骨架形成的三萜合成酶家族组成。齐墩果烷型五环三萜类衍生物的骨架为β-香树素，其合成酶为β- 香树素合酶(β-amyrin synthase，β-AS)。由于大多数植物的三萜皂苷是由齐墩果烷和达玛烷衍化得来的，所以β-香树素合酶对齐墩果烷型五环三帖皂苷的合成非常重要。三萜皂苷元骨架形成皂苷需要复杂的后期修饰才能获得最终的齐墩果烷型五环三帖皂苷产物[9]。

1.2 三萜合成的关键酶 根据萜类合成的不同阶段，以及酶在萜类合成中的不同作用，可将萜类合成酶分为前期、中期、后期酶，鲨烯合酶(SS)属于前期合成酶；β-香树素合酶属于中期合成酶；P450单加氧酶和糖基转移酶是后期酶，烯丙基转移酶和萜类环化酶催化的合成的产物通过后期酶的结构修饰生成最终产物。

1.2.1 鲨烯合酶(SS) 鲨烯是合成三萜、甾醇、胆固醇等萜烯类重要物质的共同前体。鲨烯合酶一种结合在内质网上的膜结合酶，是催化两分子的法呢基焦磷酸(FPP)缩合产生鲨烯(SQ)的关键酶，而SS的含量和活性决定了后续产物的产量，使得科学界对SS的研究非常重视。1978年Agnew和Popjak首次用脱氧胆酸从酵母中分离得到可溶不稳定的SS开始[10]，科学家们先后从动物组织和植物，植物细胞和微生物细胞中提取、分离和纯化了SS，1991年Jennings[11]通过功能互补法，利用缺失SS基因的酵母突变株与基因组DNA文库克隆了SS基因。自从烟草中分离得到SS基因开始，已有诸多物种的SS基因被克隆并被用于各分子研究。Kim T D[12]发现SS基因的过表达可使人参中甾醇和人参皂苷含量提高，Seo[13]将人参鲨烯合酶基因在刺五加中表达，发现转基因植株SS活性提高3倍，同时转基因植株的刺五加三萜皂苷类成分增加2～2.5倍，戴住波[14]克隆获得并采用原核表达体外酶促反应、GC和GC-MS等方法进行了初步功能鉴定的金铁锁鲨烯合酶cDNA，为金铁锁次生代谢工程研究奠定了重要的基础。

1.2.2 β-香树素合酶及茉莉酸甲酯调控 五环三萜碳环的生物合成只要是通过氧化鲨烯环化酶(OSC)的环化作用生成，β-AS隶属于氧化鲨烯环化酶(OSC)家族，能催化2,3-氧化鲨烯形成齐墩果酸型五环三萜的母核β-香树素，是齐墩果酸形成的关键酶，1998年Kushior[15]采用PCR第一次从人参毛状根中克隆到β-AS的cDNA；Dauenpen Meesapyodsuk[16]利用逆转录聚合酶链反应，在酿酒酵母中表达，分离并鉴定出一种由cDNA编码的β-AS(SvBS)，该β-AS主要在王不留行Saponaria vaccaria (Caryophyllaceae)的叶中进行表达；赵寿经[17]采用RT-PCR克隆了人参β-AS基因，并构建了反义植物表达载体。

茉莉酸甲酯(MeJA)普遍存在于植物界，能够显著增强基因表达从而增加植物抗毒素及次生代谢产物量，Suzuki[18]使用MeJA处理紫花苜蓿(Medicago truncatula)后发现SS基因表达量大幅提高，β-AS基因表达量增加约30倍，而次生代谢产物皂角苷含量增加了10倍；Yanling LIU[19]通过MeJA诱导秦艽，β-香树素合酶的表达量在48小时后达到顶峰，相较于没有诱导的植株，经过诱导的植株齐墩果酸的含量最大量达到1.2mg/g；刘家佳[20]使用RT-PCR和RACE克隆了金铁锁β-AS全长cDNA，构建金铁锁β-AS基因大肠杆菌表达系统，通过大肠杆菌BL21(DE3)表达了金铁锁β-AS。

1.2.3 细胞色素P450单氧酶及糖基转移酶 五环三萜碳环合成后需要经过复杂的后期修饰作用，而细胞色素P450单氧酶及糖基转移酶参与了这一过程。细胞色素P450是一类B族细胞色素超基因家族编码的蛋白酶，因还原态与一氧化碳结合后在450nm处有一吸收峰而得名。就三萜皂苷皂苷碳环骨架合成而言，大多数细胞色素P450都起到催化羟化和氧化等一系列修饰作用。自1969年Frear首次发现植物中存在P450后，直到1990年Bozak[21]才从燕麦果实中将第一个植物细胞色素P450克隆出来，Durst[22]将细胞色素P450分为两组，参与五环三萜皂苷合成的植物细胞色素P450因为具有均一的特征序列，属于A组，而非A组的细胞色素P450则不局限于植物，而参与生命体活动必须的物质合成。Qi[23]等发现细胞色素P450酶CYP5H10能催化β-香树素脂醇转化为燕麦皂苷；Carell[24]等使用激活标签法和定向诱导技术鉴定了蒺藜苜蓿细胞色素P450酶CYP716A12并证明CYP716A12催化β-香树素脂醇C-28位氧化生成齐墩果酸。

糖基转移酶催化三萜皂苷元与糖通过糖苷键相连，糖基转移酶家族成员众多，具高度专一性，已知序列的糖基转移酶没有明显的同源性，但有相似结构域。自2005年Kohara[25]等首次从刺茄中克隆得到糖基转移酶SaGT4A，研究人员已先后从苜蓿，甘草等植物中分离得到并鉴定糖基转移酶。目前关于金铁锁的细胞色素P450单氧酶及糖基转移酶的相关研究进展还未见报道，就金铁锁的细胞色素P450单氧酶及糖基转移酶还有待深入研究。

1.3 农杆菌介导法转基因发根系 发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)能侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶植物及个别的裸子植物，在植物转基因方法中，农杆菌介导法和基因枪法的应用广泛。特别是农杆菌介导法，因其具有易操作、低费用、高效率、插入片段确定性好和转基因拷贝数低等独特优点，已经成为转基因策略中的首选方法。发根农杆菌能诱发被感染植物的受伤部位长出冠缨瘤和毛状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中[26]。研究发现，Ri质粒转化系统比Ti质粒转化系统具有一定的优越性而被广泛重视。选择携带Ri质粒的发根农杆菌，在工程菌感染后会得到发根，之后对单克隆进行增殖，筛选生长迅速快，且有效成分含量高的克隆。李景滨[27]利用发根农杆菌ACCC10060菌株侵染金铁锁幼叶及茎段，建立金铁锁毛状根离体培养系统。赵爽[28]用发根农杆菌A4和C58C1菌株分别诱导金铁锁外植体获得毛状根，对维生素Cef浓度筛选，AS对毛根诱导，外植体的选择，预培养时间，侵染时间和共培养时间等毛状根诱导过程中的因素进行优化，成功建立了金铁锁毛状根诱导体系。

2 金铁锁活性成分评价以及机制研究

2.1 化学成分 金铁锁的化学成分主要为皂苷、环肽、内酰胺、糖类、有机酸和氨基酸等物质。近几年研究主要集中在五环三萜皂苷及环肽类化合物，主要有效成分是齐墩果烷型五环三萜皂苷类物质。1989年浦湘渝[29]首次从金铁锁根中提取分离得到2个齐墩果烷型五环三萜皂苷，将总皂苷水解后得到丝石竹酸、丝石竹苷元、表丝石竹苷元、16-异皂树酸、16-异皂树酸甲酯和3β-羟基-12,17-二烯-28-失碳齐墩果烷-23-醛共6种皂苷元；钟惠民[30-31]先后发现9个五环三萜皂苷化合物，属于齐墩果烷型；秦学玲[32]选择金铁锁提取物中3-O-6＇-甲基-β-D葡萄糖醛酸丝石竹苷作为指标性成分，并对其含量及纯度进行测定，建立了含量检测的HPLC方法；项世军[33]等采用HPLC建立1、3、5年生金铁锁的多组分指纹图谱，为金铁锁的鉴别和质量控制提供依据。

2.2 药理作用 金铁锁有着广泛的药理活性，研究表明其水煎液、醇提液及总皂苷具有显著的镇痛抗炎作用[34]。许建阳[35-36]等发现金铁锁水煎浸膏对实验性RA小鼠关节痛具有显著的镇痛作用，金铁锁水煎浸膏明显提高痛阈、降低血清NO/NOS。王美娥[37]等发现金铁锁水煎浸膏提高实验性RA疼痛模型痛阈值，能改善血液循环，活血化瘀止痛，提高疼痛级别，改善功能障碍，提示其水煎浸膏具有明显的镇痛、抗炎、解热作用。杨莲[38]等采用了热板法、扭体法观察金铁锁各提取分离物对昆明种小鼠的镇痛作用。金铁锁70%乙醇总浸膏与金铁锁总皂苷对扭体法模型有明显的镇痛作用，表明金铁锁具有明显镇痛作用,其镇痛作用部位可能在外周。王学勇[39-40]研究表明金铁锁的总皂苷能有效抑制佐剂性关节炎大鼠的急性炎症反应，对足肿胀有明显抑制作用，其作用机理与抑制AA大鼠促炎细胞因子水平以及炎性疼痛中枢及外周组织中c-fos基因的表达有关。另外，金铁锁总皂苷能明显抑制巴豆油至炎小鼠鼠耳肿胀程度，并对慢性增值性炎症也有一定的抑制作用[41]。

3 结语

金铁锁是西南特有的国家级保护药用植物，是云南白药的重要组成成分之一，还是许多中成药的原料用药。近年来研究表明其植物体活性成分尤其是五环三萜皂苷类物质在镇痛抗炎，调节免疫，杀菌抑菌等方面作用确切。大量的商业药用需求与金铁锁野生资源日渐稀缺形成了矛盾，目前对金铁锁活性成分基因调控及产物评价的研究还较少，可以从研究金铁锁五环三萜皂苷代谢途径，建立基因调控网络，通过基因工程方法克隆金铁锁五环三萜皂苷代谢途径中的关键酶基因进行序列分析和分子生物学手段增强关键酶的基因表达，进而增强代谢途径的代谢强度，调控五环三萜皂苷的生物合成，从而提高金铁锁五环三萜合成前体和下游产物的含量入手，着重阐明代谢途径及其调控机理是提高金铁锁五环，为基础研究以及实现大规模生产金铁锁五环三萜皂苷奠定基础。为濒危药用植物生物合成途径关键酶基因调控网络构建及其产物研究提供范例。

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ResearchprogressinthenetworkofactiveingredientsgeneregulationandproductsevaluationofPsammosilenetunicoides

JIANG Zhou QIAN Zi-gang

Yunnan University Of TCM，Kunming 650500,China

This paper reviewed the network of active ingredients gene regulation and products evaluation ofpsammosilenetunicoides.and would establish a foundation for the study and utilization of bioengineering and molecular biology inPsammosilenetunicoides.

Psammosilenetunicoides；Triterpene saponin；Biosynthesis；Regulation；evaluation

国家自然科学基金资助项目(81260609)。

江舟(1981-)，女，云南人，实验师，在读硕士研究生，研究方向：中药资源开发与利用。

R285

A

1007-8517(2014)05-0025-03

2014.01.05)