阿尔茨海默病动物模型的研究进展

薛小燕 吴君伟 郭小华 李 敏 罗焕敏

(赣州市人民医院药剂科，江西 赣州 341000)

阿尔茨海默病(AD)是以渐进性认知功能损害为特征的多病因病或临床综合征，有其特征性的神经病理，其病因与发病机制非常复杂。目前还没有一个完全具备AD所有特征的理想动物模型。理想的AD动物模型应具备以下3个方面的特征：①具备AD主要的神经病理学特征-老年斑、神经原纤维缠结和神经元及突触丢失；②具备炎症、星形胶质细胞增生等其他AD病理特征；③出现记忆和认知功能障碍。如果一种模型能同时符合以上3个方面的特征，那将是一种完美的AD动物模型。目前AD动物模型的种类有很多，但大多只模拟出AD的一部分特征，难以完全模拟出AD所有特征。本文主要综述了AD的动物模型，以期为该类疾病研究和诊治提供新思路。

1 以衰老为基础的AD动物模型

衰老可能与氧自由基对细胞的损害有关，也可能是细胞线粒体功能障碍引起能量障碍所致，还有可能与某个控制衰老的基因有关。如果能了解衰老的机制，那也就从另一方面了解到衰老促使AD更容易发生的机制了。此类模型就是以衰老作为AD的发病基础，通过各种方法促进动物衰老(包括自然衰老)来达到制作AD动物模型的目的。

1.1自然衰老认知障碍动物模型 通过动物本身的自然衰老来获得的AD动物模型，包括老龄大鼠、小鼠及猴等。这类模型的认知障碍等改变是自然发生的，较其他动物模型更贴近AD的真实病理生理改变。但老龄动物难以大量获得，容易死亡，并不能保证每一只老龄动物都具备AD的特征。

1.2快速老化小鼠(SAM)模型 竹田俊男〔1〕通过对AKR/J自然变异小鼠进行近交延代培养得到一种自然快速老化小鼠。该家族诸多品系中的SAM P/8和SAM P/10表现出明显的学习记忆功能减退、神经递质和自由基代谢改变等，常用于AD动物模型。

1.3D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型 采用D-半乳糖注射大鼠或小鼠诱导其亚急性衰老。动物表现出学习记忆力障碍、毛发稀疏、行动迟缓等老化征象。大脑中神经元丢失，神经元中细胞器减少，粗面内质网脱颗粒，蛋白质合成减少，线粒体增大呈现空泡样变性，这些病理变化与自然衰老动物的表现相似〔2〕。

2 以胆碱能学说为基础的AD动物模型

在哺乳动物脑内，基底前脑Meynert 基底核(NBM)是胆碱能神经元存在的主要部位，大脑皮质和海马中的胆碱能投射纤维70%来自于NBM。根据AD发病的胆碱能损伤学说，参照动物脑立体定位图谱，通过定位注射损毁此区域来制备基底前脑胆碱能系统损伤的AD模型。

2.1电损毁、外科损毁 通过对动物进行手术，用电灼伤的方法损毁NBM，外科手术切断海马穹隆伞。手术后动物出现了学习和记忆功能障碍，但病理上未出现SP和NFT，且这种方法损毁范围较大，目前已基本不采用〔3〕。

2.2化学损毁 通过立体定位注射的方法，将兴奋性氨基酸如鹅膏蕈氨酸(IBO)、海仁酸(KA)、使君子酸(QA)和谷氨酸等注入动物的基底前脑NBM，建立胆碱能损伤的AD模型，动物有记忆功能障碍，但并不出现SP和NFT病理改变〔4〕。

3 以AD发病的遗传学为基础的转基因动物模型

人们发现FAD基因突变的同时，便开始借助新出现的转基因技术，将人类突变的外源性基因转入动物体内来制备转基因动物模型，这已成为AD动物模型制作中一个比较常用的方法。该方法将FAD相关的突变基因转入动物中，并使外源性基因稳定遗传，改变动物遗传学性状，达到在动物体内模拟人类FAD遗传学特征的目的。

转基因动物可在体内研究某一特定致病基因的作用，是研究AD独特而重要的模型。转基因动物分为两类：第一类是含有无效基因的小鼠-基因敲除鼠，通常用于了解敲除的基因在AD发病中的功能，与此同时可以再插入相关的人类突变型基因，以避免内源性小鼠基因可能的干扰作用；第二类是AD转基因小鼠，能表达AD的突变基因，表现出相关AD表型的病理学特征，通过对已存在的AD转基因小鼠相互杂交，可以附加额外的基因来创造转双基因或转多基因小鼠。基于遗传背景、繁殖能力、操作难度、经济方面等考虑，转基因动物多选用小鼠。现有多种转基因小鼠均可表达与AD发病相关的基因，如APP、PS1、PS2等。

3.1转APP和PS基因小鼠 FAD中已发现了3个基因的突变能导致AD，即APP、PS1和PS2基因。该类模型是在建立FAD基因突变导致AD发病的遗传学基础上，将外源性APP和PS基因(野生或突变型)导入，使其在染色体基因组中稳定表达，并遗传给后代。动物过多地表达APP和PS基因或其突变基因产物，会引起Aβ沉积等相关病理损害和行为学上的改变。AD转基因动物模型发展非常迅速，各种报道层出不穷，其主要特征有以下几个方面。

3.1.1Aβ沉积 转基因小鼠过度表达FAD的APP、PS1和PS2等位基因能提高大脑Aβ水平。表达FAD突变型APP基因的转基因鼠系已建立，能产生纤维淀粉特性的SP。过度表达PS1突变型基因小鼠大脑中的Aβ42的水平大约比表达PS1野生型小鼠的Aβ42要高30%，而Aβ40水平却没有显著性差异。这些数据与PS1突变的FAD中观察到的Aβ42水平增加的结果相吻合〔5〕。转突变型PS2基因的小鼠大脑Aβ42水平也比转野生型PS2基因的小鼠更高。然而，在转PS1和PS2突变型基因小鼠中却没有出现关于Aβ沉积的报道，这可能归因于在这些小鼠中产生的Aβ(小鼠内源性Aβ)与人类Aβ在第3氨基酸残基不同，啮齿类动物Aβ在体外不像人类Aβ那样具有淀粉源性，并且转基因小鼠过多的制造鼠源Aβ显示出与人类Aβ共同的免疫反应而当成弥散性沉积。为检测突变型PS1基因对转基因鼠中人类APP代谢的影响，几个研究小组建立转双基因小鼠，同时表达PS1和APP基因的小鼠显示出加速的淀粉样沉积〔6，7〕。这些体内实验结果证实突变型PS1能影响APP的代谢过程，与体外转基因细胞实验结果相一致。这些研究表明，转突变型PS基因鼠和转 APP基因鼠相杂交生成的转双基鼠提供了脑内Aβ沉积最快形成的途径。

3.1.2胶质细胞反应性增生 胶质细胞反应性增生已在一些小鼠模型中报道。在转APP基因小鼠中报道胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色阳性的星形胶质细胞增生，用细胞形态学方法检测到小胶质细胞增生以及轴突的异常改变，但仅仅是在那些含有刚果红染色阳性斑的小鼠才检测到炎性反应。在PS1和APP双转基因小鼠中，使用针对GFAP的抗体能检测到反应性星形胶质细胞包围着Aβ沉积。以上研究表明胶质细胞反应性增生似乎与Aβ沉积相关。

3.1.3记忆障碍 小鼠的行为学研究中，Morris 水迷宫经常用于检测小鼠空间参考记忆，Y迷宫常用于检测空间近期记忆，而放射状迷宫常用于检测空间工作记忆。采用这些测试方法，在转APP基因小鼠上发现其有学习和记忆障碍。Tg257小鼠在10月龄时，与对照的非转基因小鼠相比，在Y迷宫和Morris水迷宫测试中显示出成绩明显下降，行为学障碍在6～12月龄时变得明显起来〔8〕。表明认知的损害是由于APP的过度表达所引起，而此时却没有出现淀粉样沉积。这表明转基因小鼠在Morris水迷宫和Y迷宫所表现出的认知功能下降发生在淀粉样沉积病理以前。

3.1.4其他病理改变 神经元和突触的丢失是AD的主要病理特征之一。神经元的丢失可发生在SP附近区域，这已在PDAPP小鼠中报道过。然而对18月龄PDAPP小鼠的立体测量学研究表明，其皮质、海马等有老年斑的区域没有显示出明显的神经元丢失，突触素、MAP-2、细胞色素氧化酶-2和细胞色素氧化酶-4的水平没有减少，而GFAP水平却明显增加〔9〕。对9、12月龄的转PS1基因小鼠的研究表明，其皮质和海马的神经元数量没有明显的减少。至今没有报道表明转PS1和APP双基因小鼠中出现有神经元丢失的病理改变。在过度表达PS1和APP基因小鼠中，采用银染的方法对转基因小鼠已存在的神经纤维进行分析，没有检测到NFT的病理改变。

3.2转tau基因动物模型 AD中由tau聚集形成的NFT在一些情况下与那些普通神经变性疾病中的NFT难以区别，NFT也存在于一些不含SP的神经退行性疾病，如Pick病、渐进性核上性麻痹、皮质基底退行性疾病和17号染色体相联帕金森额颞叶痴呆(FTDP-17)。这些疾病中的NFT分布有自己的特点，不像AD中的NFT只发生于神经元内，这些疾病中的NFT还分布于胶质细胞内。到目前为止，在AD病人中并未发现tau基因的异常改变，而在FTDP-17中却发现了具有致病的tau基因突变。已发现与FTDP-17发病相关的tau基因有3个突变位点，它们分别是P301L、V337M和G272V。

将人类FTDP-17突变tau基因导入小鼠中，进行表达制作转基因小鼠。人类tau基因与突变型tau基因在鼠PrP启动子控制下，在JNPL3鼠系中得到表达。该小鼠生长到10月龄大时，90%的小鼠产生了运动和行为学紊乱，出现延迟的翻正反应并且不能进入直立状态。在出现症状2 w以内，衰退扩展到所有的肢体，JNPL3小鼠几乎不能移动，出现张力障碍性体态。这些小鼠体重减轻，梳理、发音和睁眼变得困难起来。而这些运动障碍使得这些小鼠不能在Morris游泳航行实验中进行测试。脑干、端脑和间脑中出现胶质细胞增生，脊髓有48%的运动神经元减少。通过刚果红、Bielschowsky和Bodian银染方法，在脑干、间脑、小脑和脊髓证实有NFT的形成〔10〕。

4 以AD发病的环境因素为基础的动物模型

散发性AD患者在遗传学上找不到任何线索，外界环境危险因素在AD发病中起重要作用。目前只有铝元素与AD发病的关系研究比较多，并以此建立了铝元素慢性中毒的AD动物模型。钱亦华等〔11〕用AlCl3灌胃大鼠3个月建立AD大鼠模型，通过免疫组化的方法，发现其背海马结构内各部分均可见较多Aβ样免疫反应阳性神经元，虽未有SP的形成，已说明铝引起Aβ在神经元内产生增多。铝引起Aβ在神经元内沉积的机制可能与铝元素引起APP过度表达、Aβ过多的产生及铝元素促进糖基与Aβ定位连接有关。

多重复制AD模型，是在现有模型的基础上，综合两种或两种以上模型方法获得的一种复合模型。这类模型可以综合获得各种已有模型的特点，符合AD的多因素发病机制。本实验室采用D-半乳糖和AlCl3合并制备AD小鼠模型，该模型呈现了整体衰老、学习记忆功能下降、胆碱能系统功能减退、脑组织APP、PS1、BACE基因表达明显增强，脑组织出现Aβ沉积并有类SP形成，成功地模拟了AD的发病及病理特征〔12〕。该模型的制作方法简单，造价低廉，适合大规模药物筛选。就现有的AD动物模型而言，由于没有一个完全模拟出所有AD特征的动物模型，单一模型只模拟出AD部分病理改变。通过各种单一模型制作方法相复合的方法，模拟AD复杂病因，综合各种模型的特征，制作多重复制AD模型是一个比较实际而又省力的途径。

5 肾虚型AD动物模型

宋彩梅等〔13〕通过皮下注射氢化可的松15 mg/kg，注射30 d造成肾虚证小鼠模型；再通过皮下注射氢化可的松15 mg/kg复合侧脑室注射Aβ25～356 μg/只，在侧脑室注射后10 d和20 d时均可造成肾虚型老年痴呆小鼠模型。

6 其他模拟出AD部分特征的动物模型

冈田酸(OA)损害模型：OA可以选择性抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶1A和2A，能引起大鼠脑内出现类似AD双螺旋丝样磷酸化tau病理改变〔14〕。

Aβ损害模型：该模型基于Aβ的神经毒性作用，采用立体定位注射的方法。20世纪90年代起不断有报道将Aβ注射入动物大脑可引起神经毒性反应，产生记忆受损和行为学障碍〔15〕。杨晓娟等〔16〕采用大鼠侧脑室内一次性注射5 μl聚集态Aβ25～35，建立复合式AD大鼠模型。

脑缺血动物模型：人脑的供氧系统对大脑有着重要的保护作用，缺血缺氧首先影响脑的正常功能，此时极易出现智力障碍。通常老年动物的脑血流量较成年动物减少20%以上。制作老年动物慢性脑缺血的模型，可以产生类似AD的病理生理改变〔17〕。

罗焕敏等〔18〕选用NIH小鼠，腹腔注射D-半乳糖120 mg/kg和亚硝酸钠90 mg/kg，每天1次，连续60 d，制备AD动物模型。

7 结 语

综上所述，AD动物模型可分非转基因模型和转基因模型两大类。非转基因模型中，大部分AD模型只针对疾病某一方面的因素来制作AD模型，种类比较多，表现有空间学习记忆功能的衰退，大多针对AD病理的某一方面，相比AD错综复杂的病理过程来说有一定的差距，更重要的是缺乏AD脑内特征性的病理改变。非转基因模型的优点是其制作方法相对简单，成本低廉，重复性和稳定性较好，适合大规模药物筛选，多重复制AD模型能更好地模拟出AD多病因的综合作用，基本具备了AD的病理特征，是一个较好的AD模型。

转基因动物模型是AD模型中的一个热点〔19〕，小鼠中构建AD致病基因的转基因动物在AD动物模型研究方面前进了一大步。转基因小鼠在遗传学上模拟了AD的发病，出现了许多AD病理学特征的改变，包括细胞外Aβ的沉积、SP和NFT等，部分转基因小鼠还出现了炎性反应的改变。尽管疾病的一些重要标志物，如Aβ沉积和老年斑已在AD小鼠中出现，转基因小鼠也不能完全模拟出人类AD中观察到的所有特征。现在仍有争论是否这些小鼠能显示出AD其他的一些明显而重要的特征，包括突触数量的减少和神经元的丢失。这是由于AD的进程中可能包括各种不同病理途径的复杂相互作用，而非单一致病基因影响。APP的过度表达产生的作用可能在转基因鼠中是一个模糊的部分，因为在一些APP基因过度表达的小鼠中缺乏神经元丢失的特征，其原因可能是由于增加的APP，APP及其他代谢产物同样有生理或病理作用，如导致有神经营养作用的sAPPα生片的增加。产生的APPα能阻止细胞的死亡。另外，转APP基因小鼠中NFT的缺乏、受限或者没有神经元、突触的丢失也不能正确反映AD大脑中所发生的病理。因此，可制作新的AD转基因小鼠，如通过杂交使小鼠具备AD各种各样的基因突变。可以将转APP基因鼠与转FTDP-17的突变型tau基因鼠进行杂交，以获得同时具备SP和NFT两种特征的AD模型。FTDP-17在tau基因上发现了突变，值得注意的是FTDP-17病人的大脑并不出现Aβ沉积，但表现出tau的各种病理形式，包括主要的tau病理改变-NFT。由于多数AD患者是散发性的，并没有出现遗传学上的基因突变，只有不到10%的AD患者具有家族性，而其中一些病人也未能发现基因突变，转基因动物模型能模拟出AD发病的遗传学因素，不能代表人类AD的其他发病类型，特别是晚期发病的AD形式。

发现有效治疗AD的化合物必须依赖一个可靠而精确的、能最大限度模拟AD特征的动物模型。遗传学研究提供了AD致病基因而使其能设计和制造新的转基因小鼠。将两种转基因动物模型杂交制备一个既有SP又有NFT特征的动物模型或在转基因动物模型的基础上用药物的方法去产生某一方面的病理变化而产生的模型将是模型研究的良好方向。APP/PS突变小鼠与tau突变小鼠杂交所出现的表型将是一个具备两大病理特征的模型，或许有良好的前景。除了使用转多基因的小鼠来加速和增加模型小鼠的病理改变外，其他提高和改善AD转基因动物模型的策略包括使用药物或特殊神经解剖损伤来加重或削弱某个神经病理特征，或将一些非转基因模型中使用的干扰因素加入到转基因模型中，可能会改善和提高转基因动物模型。另外，一些转基因制作时的实验参数，如基因构建和鼠系的差异同样也影响转基因鼠的表型。转同样基因的小鼠，不同的鼠系影响其表型，鼠系的背景对于每一个在研的转基因小鼠都应仔细研究。通过不同实验室的努力和合作，使鼠系恢复到同一标准的基因背景下，并采用相同的方法分析，建立一个标准的转基因动物模型，以避免鼠遗传背景对其表型的影响。在更可靠、更精确的动物模型出现以前，就现有AD动物模型而言，用一种或两种比较接近AD的动物模型同时进行药物筛选或许比用单一模型来筛选药物更具说服力，也更进一步证实药物的有效性。不同的单一模型虽只模拟部分病理改变，但可以根据模型发生的病理改变来针对不同作用靶标和机制进行药物筛选，更快地找到有效药物，这样能较快将药物推向临床。

总之，有效而完善的AD动物模型将有助于AD的研究，将极大提高药物筛选的有效性。由于人和动物之间存在着差异，即便某个AD动物模型完全具备了人类AD的所有特征，最大限度模拟了AD，采用AD模型筛选到的有效药物是否对AD病人有治疗作用，最终要通过临床试验予以确认，才能予以应用。

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