用于体外实验的内皮细胞系研究进展

熊 斌 郭云亮 谭 岩 方艳秋 付 嘉

(济宁医学院临床学院外科总论教研室，山东 济宁 272067)

所有的血管，包括从最大的动脉和静脉到最小的毛细血管后微静脉，其内表面都衬贴着内皮细胞。这些内皮细胞的功能很大程度上依赖于细胞的定位以及相应血管的大小〔1〕。内皮细胞不只是被动的屏障，还可主动转运小分子、巨分子和激素，并能降解脂蛋白颗粒〔1〕。在血压调节、血液凝固和纤维蛋白溶解、炎细胞从血管进入靶组织所进行的黏附和移行、肿瘤血管发生和新生血管形成中内皮细胞进一步起主要作用，所以有人提出内皮细胞是一种条件性的固有免疫细胞〔2〕。另外有研究显示，如系统性红斑狼疮、风湿性关节炎、川崎病等自身免疫病患者血中存在的自身抗体作用的靶器官也是内皮细胞。内皮细胞功能异常会导致多种病理过程：动脉粥样硬化、出血疾病、自身免疫病、移植排斥甚至胎儿损伤死亡〔3～6〕。随着人们对内皮细胞在生理和病理情况中所起到的作用越来越感兴趣，对在血管功能状态、血凝、肿瘤血管生成、淋巴细胞黏附和移行、跨血管壁和淋巴管壁的信号传输路径等体外研究的模型系统中起代表作用的内皮细胞有了更高的需求。

1 内皮细胞可作为体外研究的模型

我们对内皮细胞功能的了解大部分来自于对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)〔7〕。HUVEC平均寿命为传代10次，可以培养5个月〔8〕。而后细胞进入“衰老”阶段，细胞停止增殖，趋于形成巨大、多核的细胞最后死亡。所以用HUVEC做长期的体外实验是不可能的。分离原代HUVEC辛苦费力，而且由于供者来源不同，分离的不同HUVEC株所得的实验结果相互之间没有可比性。人胎盘内皮细胞(HPEC)〔9〕显示有别于HUVEC的形态学特征：细胞更为伸展，在稀疏的培养中形成网络，在长至汇合时拉长的细胞形成延伸的纺锤形结构，甚至在原来单层细胞表面形成管状结构。对实验条件标准化和实验结果可重复性的要求使我们越来越需要永生性的、稳定表现内皮细胞特点的细胞系。然而，要求理想的永生细胞系显示原代细胞的所有特性对细胞本身就是矛盾的。获得永生性的细胞即使不是发生了恶性转变，也是一种非生理性变化的迹象。寻找内皮细胞系的目的就是要找到表现尽可能多的原代内皮细胞特点而尽可能少的肿瘤细胞特性。寻找内皮细胞系时要避免出现退行性变和肿瘤特点如非整倍和不稳定染色体组、软琼脂培养基生长和对裸鼠的致瘤性。

将内皮细胞用于系列实验时，我们必须确定哪些特性对证明实验设计的有效性很重要，哪些特性有利于简化实验步骤。比如说在做蛋白的产生和纯化的实验时要选择血清或无蛋白培养基，细胞衰老和永生性机制的检测要用延长但有限寿命的细胞系，而且有稳定的染色体组或端粒酶表达细胞系。研究血液-内皮相互作用时要首选表达特异性黏附分子或凝血途径成分如组织因子(TF)或组织型纤溶酶原激活物(tPA)和(或)显示淋巴细胞黏附的细胞系。适合血管生成研究细胞系应该是具有Matrigel管形成，接触抑制和锚定依赖。还有些细胞系具有所来源患者器官和病理情况的特点。研究Kaposi肉瘤(KS)应选择KS来源的细胞系，研究血脑屏障应用脑微血管细胞系。

细胞系通常分为两类：延长寿命的内皮细胞系：克服了衰老，但在危机存在时会死亡；永生性内皮细胞系：危机时也可存活，形态和抗原稳定表达。永生性细胞系通过转染、感染或与永生细胞融合而获得更长的寿命，较HUVEC更实用，所以应用比较多。然而在研究内皮细胞衰老时就不能用永生细胞系了。这些细胞多出现于永生细胞系产生前，而且都没有被用于血管相关研究，关于这些细胞特性的资料也很少。

已建立的永生细胞系可被进一步分为“大血管内皮细胞”，“小血管内皮细胞”和“无血管内皮细胞”。后者指的是骨髓内皮细胞或分离自患者损伤处或腹水的病理性内皮细胞。

2 延长寿命的内皮细胞

Gareed和Gimbrone〔〕转染HUVEC产生SVHEC。用SV40感染HUVEC，Ide等获得了SV-HUVEC。通过分离艾滋病患者Kaposi肉瘤内皮细胞，Salahuddin〔〕等得到AIDS-KS和AIDS-KS6细胞系。而后又出现了SV-2、SGHEC-7。Hohenwarter〔〕报道了两个未命名的细胞系及EC-pSV1，后者是HUVEC与人骨肉瘤细胞系134B融合而成的，其他的是用SV40基因转染HUVEC建立的。随后建立的5个细胞系：ESV108、2010-GF、2010ECGS、233和ESV2010INS、EGF在有无生长因子的条件下均可生长。

少数的微血管非永生性细胞系之一是HPEC-A1，它由SV40基因转染胎盘内皮细胞而成。简单地说，非永生长寿命的内皮细胞最适宜的模型是SV-2，Hohenwarter的两个未命名的细胞系和微血管细胞系HPEC-A1。然而，现在有许多永生性细胞系有更好的细胞特点，又有永生的优点：稳定的染色体组型和表型。基于这些特点，长寿命内皮细胞在需要非永生细胞进行研究时是最适合的。

3 永生细胞系

3.1大血管内皮细胞 最为常用而又最具有内皮细胞特点的人血管内皮细胞系是EA.hy926〔10〕，是用HUVEC与人肺癌细胞系A549融合而建立起来的。这种杂合细胞较其祖代有更多的染色体并携带一个A549系的标志染色体〔11〕。细胞生长时有接触抑制，对生长因子的需求降低，用肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激时表达vWF并上调ICAM-1、VCAM-1和E-selectin，而白细胞介素(IL)-4和干扰素(IFN)-γ不能。EA.hy926还表达tPA、PAI-1、TF和TM。蛋白激酶C的诱导剂佛波醇-12豆蔻酸-13乙酸盐(PMA)可上调其CD59表达，钙离子载体A23187和蛋白激酶A诱导剂联丁酰基环腺苷单磷酸酶。EA.hy926还用于黏附实验与几个人白细胞系，封闭单抗存在时的人外周血单核细胞(PMBC)，地塞米松存在的未刺激人中性粒细胞和鼠T细胞相互作用。Walkden等用EA.hy926研究内皮细胞转化酶(ECE)的膜锚定特性。

另一个永生人内皮细胞系是ECV-304〔12〕，1985年报道其来自于HUVEC常规培养的自发性转化事件。最近有人对ECV-304的内皮来源提出质疑，细胞间接触提示其部分表皮来源。最终Brown等提出ECV-304的遗传学身份是膀胱癌来源的表皮细胞系T24/83。ECV-304不再被认为是内皮细胞来源。

Faller等用小鼠肉瘤病毒假模建立了两个稳定的人内皮细胞系HEC-KSV和HEC-MSV。Schwartz等用SV-40基因转染产生永生性的静脉内皮细胞IVEC。Sasaguri等从死于肺癌的52岁男性分离了大动脉内皮细胞(HAEC)并用SV40病毒处理，得到SE-1。Cockerill等报道了一例HUVEC培养中发生的自发性转化事件，得到细胞系C11STH。Fontijn等将人乳头瘤病毒E6/E7整合入HUVEC使之永生化，产生EC-RF7和EC-RF24细胞系。Moldovan等将HUVEC永生化用于研究内皮转化酶ECE，如细胞系CEH。Tonqueze等融合了HUVEC和A549/8，得到两个克隆Hy1和Hy2。Van Leeuwen等永生性细胞系EVLB3和EVLC2产生自HUVEC、EVLK1和EVLK2来自于人回肠静脉内皮细胞。

为了研究血管内皮细胞老化和凋亡，人们用人端粒酶反转录酶(hTERT)基因转染了一系列不同血管起源的原代内皮细胞。HUVEC，人大动脉内皮细胞(HAEC)，人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)，人隐静脉内皮细胞(HSVEC)和人皮肤微血管内皮细胞(HDMEC)经转染或逆转录病毒转导获得hTERT阳性克隆。转化细胞呈铺路石样单层接触抑制生长，表达vWF和PECAM-1、ICAM-1、VCAM-1和E-selectin阳性，Matrigel管形成，摄取acLDL，在软琼脂培养基上不生长。转化并不改变内皮细胞的基因状态。hTERT-HAEC细胞系与对照的亲代内皮细胞或转染细胞相比，对凋亡诱导更不敏感，大血管内皮细胞系仍然表现原代内皮细胞的优点，凋亡敏感性下降也是原代的表型。

3.2小血管内皮细胞 微血管内皮细胞分离自人胎盘新生包皮、成年人皮肤、脂肪组织和其他的微血管环境〔13,14〕。目前建立的微血管内皮细胞很少，是用SV40大T抗原(HMEC-1，SV-HCEC)，多瘤病毒(iSEC或hTERT逆转录病毒(hTERT-HDMEC)转染而成的。永生化的胚窦肝细胞(iSEC)，具有胚胎内皮细胞的特征。表达细胞角蛋白7，8和18，提示其为间充质起源。Ades等从人皮肤微血管内皮细胞建立了一株细胞系CDC/EU.HMEC-1(通常叫HMEC-1)能在无血清条件下生长，细胞表现人微血管内皮细胞的形态学，表型和功能特点。Yosef等〔15〕分离并永生化了脑微血管内皮细胞(HCEC)，产生SV-HCEC。

3.3非血管内皮细胞 人骨髓中包含内皮细胞及其前体。当骨髓细胞被某种药物动员起来或从外周血分离时，骨髓相关内皮细胞也同时被分离出来。内皮细胞前体可从外周血中分离出来，在体外能发生分化，在体内能形成内皮细胞〔16〕,但至今未见永生细胞系的报道。这些内皮细胞不能归入小或大血管来源的内皮细胞而自成一类。三个骨髓来源的内皮细胞BMEC-1、TrHBMEC和HBME-1特性很相似，均由SV40基因转染获得。

3.4病理性内皮细胞 Cooper等〔17〕提出细胞系SKHEP-1是内皮细胞来源。SKHEP-1来自肝腺癌患者腹水。曾被报道说是肝细胞癌来源。然而，Northern杂交未见白蛋白、α和γ纤维蛋白原mRNA。电子显微镜显示吞饮小泡，WP小体和大量的间丝。细胞不结合UEA，但表达vWF和E-selectin，形成Matrigel管，提示细胞系微内皮细胞来源。

Liu等〔18〕从肝血管肉瘤建立细胞系HAEND，此患者是接触氯化乙烯气体40年的矿工，在接受肝移植后肝血管肉瘤复发。HAEND并没有铺路石样形态，而是呈纺锤型，是肝血管肉瘤的形态特点，失去了接触抑制，生长时不需要凝胶，纤粘蛋白和血清、vWF、ICAM-1、TF、补体受体3(CR3)、HLA-Ⅰ均为阳性，HLA-Ⅱ阴性。

综上，目前对永生细胞系的选择很多。最常用的和最具特点的是EA.hy926〔11〕和ECV304〔12〕，后者现已知并非内皮细胞起源〔12〕。此后又报道了很多新的细胞系。例如IVEC在内皮细胞标志的表达和上调方面显示与原代HUVEC高度的相似性，但却含有SV40基因，C11STH有相似的特性但却来自自发性突变事件。大、小血管hTERT细胞系有许多原代内皮细胞的优点而不显示转化表型。还有特殊的内皮细胞系如血脑屏障细胞系SV-HCEC，肝窦细胞系Isec或骨髓来源的BMEC-1细胞系和TrHBMEC-1。HMEC-1是最早的微血管细胞系，广泛用于不同的内皮研究，具有原代微血管内皮细胞的许多优点。

Lidington等将三种常用的内皮细胞系HMEC-1、ECV304和EA.hy926与原代内皮细胞进行对比。作者对比了涉及淋巴细胞和单核细胞相互作用及跨内皮移行的表面抗原的表达，提出HMEC-1与原代内皮细胞最相近，ECV304与原代内皮细胞相差最远。这与ECV304具有成瘤特性甚至不是内皮细胞起源的报道相一致，故而ECV304作为内皮细胞体外模型比较缺乏吸引力。

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