猪流产嗜性衣原体病诊断方法研究进展

张文通 魏凤,2 李峰,2 苗立中,2 沈志强,2

（1山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

猪流产嗜性衣原体病诊断方法研究进展

张文通1魏凤1,2李峰1,2苗立中1,2沈志强1,2

（1山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

猪流产嗜性衣原体病是引起母猪流产，产弱胎、死胎的重要传染病之一，严重危害养猪业的健康发展。正确诊断对防制该病极为关键。本文就该病的病原学诊断、血清学诊断、分子生物学诊断方法进行了综述。

猪流产嗜性衣原体；诊断方法；进展

猪流产嗜性衣原体病的病原是流产嗜性衣原体，该病原能导致母猪流产、公猪生殖道疾病，甚至能导致孕妇感染而引起流产。随着集约化养猪业的发展，该病的感染率有所增加，已受到越来越多从事养猪业工作者的重视。在国外，Willigan等[1]首先于1955年从患病猪病料中分离到该病的病原；在国内，杨宜生等[2]于1982年首次从流产母猪及患关节炎仔猪病料中分离到该病的病原。目前，全国大多数养猪地区都有关于该病的报道。邱昌庆等[3]、何启盖等[4]、罗建等[5]对部分地区猪血清衣原体阳性率进行了调查研究，发现该病抗体阳性率普遍很高，说明该病在我国养猪业中广泛存在，应引起从业人员的高度重视。目前该病还没有有效疫苗可供使用。本文就猪流产嗜性衣原体病的诊断方法进行综述，旨在为广大从事养猪生产或研究的工作人员提供参考。

1 病原学研究

1.1 病原的分离培养

病料分离常用的方法是鸡胚传代法和细胞培养法。鸡胚传代法最为常用。将病料（病料采集取自有症状或病变部位，比如流产胎儿器官、胎盘和子宫分泌物，患关节炎的也可采集关节液）接种于孵化5～7天的鸡胚卵黄囊内。对于不能适应鸡胚传代的菌株或初次分离的菌株，建议将病料接种于无特定病原的小鼠或豚鼠。也可将病料接种于McCoy或HeLa229细胞或BHK细胞进行分离培养，但实际工作中因耗时、工作量大等难点并不常用，不适用于大规模的流行病学调查。

1.2 病原的鉴定

将采自典型部位病料或卵黄囊培养物涂片，Gimenez法染色镜检，可见蓝绿色、直径约为0.5～1.4μm小大的圆形产物，部分位于细胞内，大量散布于细胞外，聚集的群体形成网状小体。也可将病变组织涂片，采用姬姆萨染色法，镜检可观察到菌体呈紫红色或宝石红色，直径大约为0.1～0.6μm，并可观察到红色的胞浆内包涵体。直接免疫荧光试验（IFA）是OIE推荐的诊断方法，有商品化的试剂盒。将荧光标记的多克隆抗体或单克隆抗体滴加到组织抹片或者细胞片，37℃湿盒孵育30分钟，然后用PBS冲洗3次，自然晾干，在荧光显微镜下进行观察，阳性的可见绿色荧光的包涵体。

2 血清学方法

2.1 间接血凝试验（IHA）

间接血凝试验是将抗原（或抗体）包被于红细胞表面，成为致敏的载体，然后与相应的抗体（或抗原）结合，从而使红细胞拉聚在一起，出现可见的凝集反应。该方法在临床检验中已得到广泛应用。目前市场上已经有产自湖北省农科院畜牧兽医研究所和中国农科院兰州兽医研究所的商品化流产嗜性衣原体间接血凝试剂盒，文献研究显示该试剂盒已在全国被广泛应用于衣原体病的流行病学调查。

2.2 补体结合试验（CFT）

补体结合试验是指利用抗原抗体复合物同补体结合，把含有已知浓度补体反应液中的补体消耗掉，使浓度降低的现象，以检出抗原或抗体的试验。补体结合试验是OIE推荐的经典诊断方法，已广泛用于家畜衣原体病的流行病学调查。但该方法操作步骤过于复杂、需要专业知识操作，因此在基层应用推广中受到很大限制。

2.3 间接免疫荧光试验（IMIF）

间接免疫荧光试验其染色原理分两步：第一步，将未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃保温30分钟，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体；第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体；如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。间接免疫荧光试验缺陷在于操作步骤繁琐、特异性差等，不利于实际推广及应用开发。

2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）

酶联免疫吸附试验是酶免疫测定技术中应用最广的技术，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。间接ELISA法用于测定特异抗体。ELISA方法具有快速、准确、特异、敏感、实用性强等特点。

科研工作者在建立检测流产嗜性衣原体抗体ELISA方法上做了大量研究工作。1995年Anderson等[6]将衣原体进行纯化，将纯化后的衣原体原体作为ELISA的包被物，建立了ELISA检测方法。1996年Griffiths等[7]将纯化后的脂多糖抗原（从衣原体表面抗原中提取）作为包被物，建立了ELISA检测方法，该方法与补体结合试验同时检测羊血清，结果表明ELISA方法敏感度高于补体结合试验。

40 kDa的衣原体主要外膜蛋白（MOMP）具有血清型、亚种、种和属特异性抗原决定簇，是衣原体病诊断的主要研究抗原。1997年Kaltenboeck等[8]合成衣原体主要外膜蛋白中的部分肽片段，作为包被物，建立了间接ELISA方法，该方法与以其他衣原体抗原作为包被物建立的ELISA方法相比，敏感性更高。同年，Salti-Montesanto等[9]在获得流产嗜性衣原体单克隆抗体的基础上建立了竞争ELISA方法。

2001年Buendía等[10]以重组流产嗜性衣原体80～90 kDa蛋白抗原为包被物建立ELISA方法，与以纯化的衣原体原体进行包被建立的ELISA方法相比，敏感性更高。2006年Rekiki等[11]制备了以流产嗜性衣原体重组80～90 kDa家族蛋白作为包被原的ELISA试剂盒，但该试剂盒与补体结合试验符合率只有61.1%，与以纯化的衣原体原体进行包被建立的ELISA方法符合率只有65%。

多型性外膜蛋白（POMP）可以产生很高的免疫活性，也常被作为候选抗原用于研制诊断试剂。2007年Mccauley等[12]采用基于POMP90-3、POMP90-4、POMP80-90和MOMP建立的ELISA方法和CFT方法检测阳性血清；结果表明，敏感性POMP90-3＞POMP90-4＞POMP80-90＞MOMP＞CFT，特异性CFT和POMP90-4＞MOMP＞POMP80-90＞POMP90-3。2009年梅仕林[13]采用以重组流产嗜性衣原体POMP蛋白为包被抗原，建立检测猪流产嗜性衣原体抗体的间接ELISA方法。特异性研究表明，该方法检测猪乙脑阳性血清、猪伪狂犬阳性血清、猪瘟阳性血清及猪繁殖与呼吸综合征阳性血清均阴性，具有很好的特异性；符合率试验显示，该ELISA方法与IHA方法符合率为92.8%。应用该方法调查河南、湖北、安徽及广东四个省份的猪场，试验猪群均有猪流产嗜性衣原体感染，阳性率平均在30.7%。

3 分子生物学方法

PCR诊断技术又叫多聚酶链式反应技术，它采用分子技术模拟核酸在体内的复制，从而判定疾病病原的种类。PCR技术不需要观察动物的外观表现，所以无论是在潜伏期还是暴发期，只要对动物的相应器官进行检测，在两个小时内就能准确判定出畜禽疾病的病原。由于PCR技术具有简便、快速、灵敏、特异性强等特点，科研工作者运用PCR技术对猪流产嗜性衣原体病进行了大量研究。

1997年Messmer等[14]根据16s rRNA基因保守序列设计引物，建立了两步PCR方法，试验结果表明该方法敏感度远高于分离培养法。2001年Laroucau等[15]根据流产嗜性衣原体的pomp基因保守序列，设计引物，建立PCR方法。该方法与RFLP分析方法一起，可以对流产嗜性衣原体种和血清型进行鉴定。2005年Markey等[16]根据衣原体16s rRNA基因保守序列设计引物，也建立了实时定量PCR方法，通过检测阳性病料，比较该方法与常规PCR方法的敏感性，试验结果表明常规PCR方法检测阴性的12份病料，而实时定量PCR方法检测均为阳性。

[1] Willigan DA,Beamer PD.Isolation of a transmissible agent from pericarditis of swine[J]J Am Vet Med Assoc,1955,126 (935):118-122.

[2] 杨宜生,姜天童,方雨玲.衣原体和动物衣原体病[J].湖北畜牧兽医，1982（2）：47-51.

[3] 邱昌庆.关注鹦鹉热衣原体对养猪业的危害[J].今日养猪业, 2004（2）：22-24.

[4] 何启盖,陈焕春,吴斌,等.猪衣原体病和布鲁氏菌病血清学调查[J].中国兽医科技,2000,30（3）：13-14.

[5] 罗建,杨小燕,戴爱玲,等.规模化猪场母猪衣原体病的血清流行病学调查[J].福建畜牧兽医，2006,28（5）：4-5.

[6] Anderson IE,Herring AJ,Jones GE.Development and evaluation of an indirect ELISA to detect antibodies to abortion strains of Chlamydia psittaci in sheep sera[J].Vet Microbiol, 1995,43(1):1-12.

[7] Griffiths PC,Plater JM,Horigan MW,et al.Serological diagnosis of ovine enzootic abortion by comparative inclusion immunofluorescence assay,recombinant lipopolysaccharide enzyme-linked immunosorbent assay,and complement fixation test [J].J Clin Microbiol,1996,34(6):1512-1518

[8] Kaltenboeck B，Heard D，DeGraves FJ，et al.Use of syntheticantigensimprovesdetectionbyenzyme-linkedimmunosorbent assay of antibodies against abortigenic Chlamydia psittaci in ruminants[J].J Clin Microbiol,1997,35(9):2293-2298.

[9] Salti-Montesanto V,Tsoli E,Papavassiliou P,et al.Diagnosis of ovine enzootic abortion,using a competitive ELISA based on monoclonal antibodies against variable segments 1 and 2 of the major outer membrane protein of Chlamydia psittaci serotype 1[J].Am J Vet Res,1997,58(3):228-235.

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[12] Mccauley LM,Lancaster MJ,Butler KL,et al.Comparison of ELISA and CFT assays for Chlamydophila abortus antibodies in ovine sera[J].Aust Vet J,2007,85(8):325-328.

[13] 梅仕林.猪流产嗜性衣原体病间接ELISA抗体检测方法的建立[D].武汉：华中农业大学,2009.

[14] Messmer TO,Skelton SK,Moroney JF,et al.Application of a Nested,Multiplex PCR to Psittacosis Outbreaks[J].J Clin Microbiol,1997,35(8):2043-2046.

[15] Laroucau K，Souriau A，Rodolakis A.Improved sensitivity of PCR for Chlamydophila using pmp genes[J].Vet Microbiol, 2001,82(2):155-164.

[16] Markey B,Wan C,Vaughan R.Quantitative detection of chlamydial infections in animals using a real time polymerase chain reaction assay based on a conserved region of the 16s RNA gene.Diagnosis and Pathogenesis of Animal Chlamydioses [M].SIENA:Bononia University Press.2005:129-139.

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