铁皮石斛内生真菌研究进展△

方香香，张寿文

(江西中医药大学，江西 南昌 330004)

综 述

2014年江西中医药大学校级研究生创新专项资金项目：铁皮石斛内生真菌共生培养体系研究(JZYC14B08)

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张寿文，教授，研究方向：中药资源与开发；Tel：(0791)87118994，E-mail：hero220@163.com

铁皮石斛内生真菌研究进展△

方香香，张寿文*

(江西中医药大学，江西 南昌 330004)

研究表明植物内生真菌与植物之间形成互利共生的关系，具有促进植物生长次生代谢产物积累等功能。本文简要综述了近年来铁皮石斛内生真菌的分离、多样性、促生作用、诱导子效应及生物活性等方面的进展，为今后的相关研究提供参考。

铁皮石斛；内生真菌；多样性；促生作用；生物活性

铁皮石斛Dendrobiumofficinale是兰科Orchidaceae石斛属多年生草本植物，具有生津养胃，滋阴清热，润肺益肾，明目强身等功效，《道藏》中将铁皮石斛列为“中华九大仙草”之首。现代药理研究发现铁皮石斛能增强免疫力、抗衰老、抗肿瘤、降血糖、降血压等功效[1]。由于其极高的药用价值，铁皮石斛野生资源被大量采挖，加上其特殊的生长环境，铁皮石斛的野生资源正濒临灭绝。有益微生物与植物组织外植体共同培养，植株的发育与代谢会发生变化，且植株对生物与非生物胁迫的抵抗力也会提高[2]。研究发现铁皮石斛内生真菌对铁皮石斛种子萌发及其生长有显著地促进作用，并且还能提高次生代谢产物含量。本文对近十几年关于铁皮石斛内生真菌的分离、多样性、对植株生长的影响及生物活性等方面进行综述，并对铁皮石斛内生真菌研究前景进行了展望。

1 内生真菌的分离

在植物内生真菌的分离过程中，除了尽可能保持组织的新鲜外，外植体表面的杀菌和分离培养条件是两个关键因素。杀菌强度太大，不仅将表面微生物杀死，杀菌剂还可进入材料内部，杀死分布于表皮下的内生真菌，使所分离的内生真菌的种类和数量受到影响；杀菌强度过低，又会使表面真菌混于内生真菌中，造成分离失败[3]，因此选择合适的杀菌剂和杀菌时间非常重要。铁皮石斛分离内生真菌组织材料表面消毒有采用乙醇与升汞的组合，吴凤慧[4]研究结果显示用75%酒精处理30 s后再用0.1%的升汞溶液处理3 min铁皮石斛，根段消毒彻底且分离菌株最多；也有采用乙醇与次氯酸钠的组合，如75%酒精处理30 s再用3%次氯酸钠消毒4 min[5]。

分离所用的培养基对真菌的种类和数量也有影响，生长缓慢和不能在人工培养基上生长的真菌很难分离出来，因此有必要采取多种培养基来进行内生真菌的分离。如用察氏培养基分离美花石斛内生真菌，分离菌株比PDA培养基和麦麸糖培养基分离多，而PDA培养基和麦麸糖培养基分离出的菌株一样[6]。铁皮石斛内生真菌的分离在培养基选择上大多采用PDA培养基。PDA和FIM两种培养基分离铁皮石斛内生真菌，所得的菌株不一样，可能是因为PDA和FIM所含的成分不同，真菌对营养的偏好有所差异，而使得分离结果有所不同[4]。

2 内生真菌的多样性

铁皮石斛内生真菌种类、数量和分布存在较大的多样性，主要属担子菌门、半知菌门[7]和子囊菌门[8]中几十个属。胡克兴和陈玉栋等[8-9]从铁皮石斛不同组织中分离内生真菌，发现根、茎、叶中均存在内生真菌，但是菌株种类、数量以及分布情况有所不同，其中根和茎部位的内生真菌种类和数量较叶多，镰刀菌属是优势种群。

内生真菌的多样性也存在于不同生长环境间。毛益婷等[10]将两个处于生长期但不同生境中的铁皮石斛营养根内生真菌进行Simpson多样性指数分析，显示雅长(0.984)地区铁皮石斛内生真菌多样性指数高于良山(O.965)，由于两个地方铁皮石斛的生长环境不同，内生真菌表现出不同的多样性。

张丽[11]从铁皮石斛栽培苗中分离出内生真菌但无菌苗中没有分离出，并且栽培苗中内生真菌种类和数量随生长年限的增长而呈现增多趋势。曹斌等[12]通过对营养根组织解剖和显微观察，发现只有当小苗接触栽培基质才能观察到菌丝。表明铁皮石斛内生真菌不是从一开始就存在于植株内，而是通过生长环境中的栽培基质进入植物组织内才形成的。由此可见生长年限和栽培基质也是铁皮石斛内生真菌多样性的原因。

3 内生真菌对铁皮石斛生长的影响

3.1 内生真菌与植株共生培养

内生真菌与铁皮石斛组培苗共生，不论是地上部分植株还是地下部分根系生长内生真菌都有较强的促进作用，增加植株高度促进长出新芽和新根[13]。接菌苗与对照组相比，平均鲜重增长率、大量和微量元素含量都有所增加[14-15]，叶绿素含量和N、K、P含量均比对照组高，内源激素GA3(赤霉素)和IAA(吲哚乙酸)含量增加ABA(脱落酸)含量降低[16-17]。内生真菌作为菌肥还能提高铁皮石斛的存活率，显著促进植株生长[18]。此外，铁皮石斛内生真菌与原球茎和种子共生对原球茎的生长和种子的萌发也有促进作用。高微微等[19]采用唇兰小菇、石斛小菇、兰小菇与组培苗进行共生培养，发现三种内生真菌均能促进铁皮石斛苗生长，接种了石斛小菇和兰小菇的铁皮石斛原球茎增殖较明显。吴慧凤[4]共生培养结果显示有四种菌株均不同程度地促进了铁皮石斛种子的萌发，菌株C22能极显著的促进作用原球茎的鲜重增长率。铁皮石斛内生真菌还能促进铁皮石斛次生代谢产物的积累，增加多糖含量[20]。

虽然兰科植物在自然条件下只有与内生真菌共生才能正常生长，但是并非所有的内生真菌对植物都是有利的，有的是致病菌，与植物共生使植物不能正常生长甚至死亡，有的则对植物生长没有任何影响，既不抑制也不促进[21]。

3.2 真菌诱导子对植株生长的影响

真菌诱导子是来源于真菌的一种特定化学信号，在植物与真菌的相互作用中，能引起植物细胞合成积累次生代谢物，对植物具有专一性[22]。它主要是真菌的细胞表面结构或分泌物，可以是真菌菌丝体、灭活菌丝体、发酵液和分泌物等。铁皮石斛真菌诱导子的研究表明，真菌诱导子能促进铁皮石斛生长[23]，并且受诱导子加入时间的影响表现出不同的作用，陈晓梅等[24]发现在培养后期加入真菌诱导子多原球茎生长有促进作用，在培养前期加入则对原球茎生长有抑制作用。真菌诱导子还对铁皮石斛的化学成分有一定的影响。宋经元[25]、杨慧[26]和陈晓梅等[27]研究表明真菌诱导子能促进次生代谢产物多糖和生物碱的积累，且诱导子制备方法、加入量、加入时期以及培养时间都会影响次生代谢产物的积累量[28]。另外陈晓梅等[29]HPLC-MS指纹图谱分析发现真菌诱导子并没有改变铁皮石斛原球茎中的化学成分，但是能提高化学含量，而侯丕勇[30]采用薄层色谱和HPLC方法，结果显示加入真菌诱导子后铁皮石斛原球茎产生了7种新的化合物，其中3种是野生铁皮石斛所特有的。

4 生物活性

研究发现铁皮石斛内生真菌对铁皮石斛黑斑病菌AF-02和AF-04有抗菌活性，通过对6种病原微生物的抑菌试验，结果显示其中的10株内生真菌对至少1种指示菌具有抑菌活性[31]。从铁皮石斛中分离出的石斛小菇的发酵液对小鼠中枢神经系统有兴奋作用，菌丝体和发酵液的粗提物能产生与中药石斛相似的镇痛作用[32]。此外，铁皮石斛内生真菌发酵产物对HBsAg(乙肝表面抗原)[11]、HIV-1(人类免疫缺陷病毒-1)[33]也有一定的抑制作用。

5 问题与展望

目前，铁皮石斛内生真菌的研究主要集中在内生真菌的分离、促生内生真菌的筛选及诱导子作用这几个方面，虽然已经能够分离出能有促进作用的内生真菌，但是将内生真菌运用到铁皮石斛的规范化生产中还需要进一步的研究，例如铁皮石斛内生真菌与组培苗共生培养的适宜条件，共生培养对铁皮石斛质量的影响，菌剂的开发等等。另外，目前研究的主要对象还是铁皮石斛植株，对内生真菌本身的研究很少。许多报道表明内生真菌能产生与宿主相同或相似的生理活性，例如从红豆杉的树皮中分离出的内生真菌能产生紫杉醇[34],桃儿七的茎韧皮部分离出一株能产生鬼臼毒素的内生真菌[35]。微生物作为可再生利用资源，繁殖速度快且易保存，如果能从铁皮石斛中分离出产生与宿主相同或相似作用的内生真菌，再通过人工发酵的方法产生次生代谢产物，这将为缓解铁皮石斛资源短缺提供新的可能。

自然界中植物体内存在多种微生物，这些微生物在植物生长的过程中分别担任着不同的角色来促进植物种子萌发并长成健壮的植株，所以单单只研究某一种微生物对植株的影响是不全面的。此外，植物体内与之共生的微生物除了真菌以外还有细菌，有研究发现内生细菌也能促进铁皮石斛组培苗显著生长[5]，因此内生细菌的促生效应也具有研究价值和意义。

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AdvancesinResearchofEntophytesfromDendrobiumofficinale

FANGXiangxiang,ZHANGShouwen*

(JiangxiUnivercityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China)

Many studies have shown that endophytes forming a symbiotic relationship with plants could promote growth of plants and accumulation of secondary metabolites.The separation,diversity,growth-proving,inducer effects and biological activities of entophytes were reviewed in this article,which will provide reference for further study.

Dendrobiumofficinale;Endophytes;Diversity;Growth-promoting effect;Biological activities

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.020

2013-12-24)