乳头层和网状层成纤维细胞在皮肤形态发生和内稳态中彼此独特且互补的作用

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乳头层和网状层成纤维细胞在皮肤形态发生和内稳态中彼此独特且互补的作用

真皮层是人类皮肤的重要组成部分，位于由多层角质形成细胞组成的表皮与皮下组织之间。真皮与表皮通过基底膜带(BMZ)既被相互分隔又有密切的联系。目前研究认为，真皮可分为两个不同的部分，分别为表浅部的乳头层和深部的网状层。这两层的组成和结构在细胞外基质、细胞密度和存在的神经及血管结构等方面有明显不同。Ⅲ型胶原主要存在于真皮乳头层，而Ⅰ型胶原则二层均可见，Ⅰ型前胶原优先产生于靠近表皮的乳头层。核心蛋白聚糖和双链蛋白聚糖(蛋白聚糖家族)也优先表达于乳头层，网状层内几乎不表达。真皮结构蛋白(如肌腱蛋白亚型)在真皮内也具有明确的分布特点，肌腱蛋白C分布于乳头层，肌腱蛋白X分布于网状层。成纤维细胞是真皮主要的细胞类型。成纤维细胞产生ECM的成分并对其进行组织，且通过称为整合素的膜受体与ECM相互作用。成纤维细胞还通过分泌分子和可溶性因子参与皮肤生理学功能的调节，如细胞因子、基质金属蛋白酶(MMP)及其基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)。

近年来，已证实真皮成纤维细胞并非同一群细胞，至少可被分为两种亚群。乳头层成纤维细胞(papillary fibroblasts，Fp)，聚集于真皮表浅部、表皮下方，由表皮真皮连接部(DEJ)将其与表皮隔开；网状层纤维细胞(reticular fibroblasts，Fr)位于其余真皮部分。有文献报道，这两种类型的真皮成纤维细胞在体外培养时特性不同，如细胞形态和增殖速率。研究还证实，Fp的生物学特性会随年龄增长而改变，老年人皮肤内的Fp数量明显减少。乳头层成纤维细胞的密度高于网状层内的成纤维细胞，且其代谢活性更强。体外培养时，从真皮乳头层和网状层分离的成纤维细胞显示出不同的特性。Fp比Fr的生长能力强；相比Fp的细胞形态，Fr则更多表现为树突状和伸展状。此外，Fr比Fp的细胞汇合密度低，且接触抑制敏感性较高。

在单层培养物中，两种成纤维细胞亚群均能合成细胞外基质大分子，但合成的种类和数量不同。例如，Fr产生的Ⅰ型胶原和多功能蛋白聚糖多于Fp；而Fp产生的核心蛋白聚糖多于Fr。两种细胞亚群产生的细胞因子和激素也均有不同。例如，Fp合成的GM-CSF多于Fr；相反，Fr产生的KGF多于Fp。总之，这些结果证实，培养的真皮乳头层和网状层成纤维细胞其特性有差异。然而，尚无研究显示这两种亚群对人皮肤形态发生(重建)的影响。该研究的目的是调查这两种真皮成纤维细胞亚群在人体外重建皮肤(其结构接近于在体皮肤)形态发生中所起的作用。为此，该研究使用了人体外重建皮肤3D模型，其真皮由Fp或Fr成纤维细胞填充。该研究显示，皮肤真皮乳头层和网状层成纤维细胞的作用既有差异，又互为补充，提示二者对人皮肤的正常形态发生和内稳态都是必需的。

一、材料和方法

1.细胞培养：乳头层和网状层成纤维细胞来源于3名19～21岁的年轻白种人捐赠的乳房皮肤。使用皮刀分离真皮乳头层和网状层。将切片置于培养皿内培养分离伸展开的乳头层或网状层成纤维细胞。将乳头层或网状层成纤维细胞平铺在150 cm2的培养瓶内，密度为1×104细胞/cm2。成纤维细胞在添加了非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、青霉素-链霉素(20 U/ml)和10%胎牛血清的MEM(minimum essential Eagle's medium)内生长。培养物保存于37℃、95%湿度和5%CO2环境下。每周更新3次培养基，直至成纤维细胞培养进入亚汇合状态。该研究的角质形成细胞来源于1名30岁白种人捐赠的乳房皮肤。

2.人体外重建皮肤：使用包埋于牛Ⅰ型胶原凝胶内的人真皮乳头层或网状层成纤维细胞(每个培养格1×106个成纤维细胞)制备真皮替代物(胶原成纤维细胞收缩格)。终体积为7 ml(含培养基)，包括2 ml的胶原(浓度为3.5 mg/ml)。培养格在37℃和5%CO2环境下可以收缩5 d。使用不锈钢圈将人表皮角质形成细胞种植在真皮替代物上，进行表皮重建。将培养物浸没培养1周，然后提至气液交界处的网格上1周，以产生分层和分化的表皮。使用添加10%胎牛血清、10 ng/ml表皮生长因子(EGF)、8.4 ng/ml霍乱毒素和0.4 μg/ml氢化可的松的MEM，培养基每周更新3次。

3.组织学处理：样本被固定在中性甲醛内，进行组织学处理。用苏木精、伊红、藏红花(HES)染色石蜡切片。

4.免疫组织化学：样本包埋在Tissue-Tek内，切成5 μm的切片液氮冻存。小鼠单克隆抗体抗：人丝聚蛋白、角蛋白10、原纤蛋白1；大鼠单克隆抗体抗人Ⅰ型前胶原；兔多克隆抗体抗人Ⅲ型前胶原；兔多克隆抗血清抗人兜甲蛋白；小鼠单克隆上清液(蛋白聚糖抗体)抗人皮肤素和抗硫酸软骨素链。异硫氰酸荧光素(FITC)结合的兔抗小鼠免疫球蛋白，或Alexa结合的山羊抗小鼠免疫球蛋白，或FITC结合的山羊抗大鼠免疫球蛋白，或FITC结合的猪抗兔免疫球蛋白被用作二抗。使用普罗匹定碘化物进行核染色。在荧光显微镜下观察并成像染色的组织切片。

5.酶联免疫吸附测定MMP1、MMP3、VEGF和KGF：使用ELISA试验测定组织培养基内基质金属蛋白酶-1(MMP1)、间质胶原酶、基质金属蛋白酶-3(MMP3)、基质降解酶、角质形成细胞生长因子(KGF)、血管内皮生长因子(VEGF)的含量。

6.酶谱分析：用NOVEX预制酶谱凝胶通过检测蛋白水解活性来研究金属蛋白酶。具体方法参见原文。

7.对样本进行RT-PCR、逆转录和定量PCR的分析：具体方法参见原文。

二、结果

1.人真皮的两层结构分别含有两种不同的成纤维细胞亚群：人皮肤的外部为分层的表皮(E)，其下方相对较薄的一层真皮结构对应为真皮乳头层(DP)，而较厚的深部层对应为真皮网状层(DR)。组织学研究显示，角质层由表皮内角质形成细胞产生，并证实真皮乳头层与网状层的基质结构有显著差异。

2.体外培养的乳头层和网状层成纤维细胞的增殖速率和胶原收缩：比较短期培养物中Fp和Fr各自的生长率。Fp的生长率明显高于Fr。在培养结束时(23d)，Fp的数量是Fr的两倍。单层培养物组织学结果显示，二者细胞形态有差异。4 d后评估Fp和Fr的胶原凝胶收缩能力。凝胶的收缩在Fr存在时更为明显，尤其是在初始收缩期(第1个24 h)。

3.真皮乳头层成纤维细胞的存在促进表皮的最佳分化：表皮分化的连续性形态学变化与角质形成细胞的主要基因产物的表达有关，如角蛋白和中间丝相关蛋白等。角质形成细胞分化的4个阶段与表皮各层相对应：基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层。角蛋白10的免疫组织学染色证实了两种成纤维细胞亚群均能维持表皮的形态发生。角蛋白是角质形成细胞分化标记物之一，在Fp和Fr存在时大量表达。比较用Fp或Fr构建的人体外重建皮肤的组织学特征，发现两个皮肤模型的表皮层存在着明显差异。Fp存在时，表皮分层和分化表现最佳；反之，Fr存在时，表皮结构化程度较低，颗粒层缺乏。中间丝蛋白和兜甲蛋白的免疫染色可证明颗粒层的分化水平，两种标记物在Fp存在的条件下均可大量表达，而Fr存在时表达较低。RT PCR的定量分析也在mRNA水平上证实了这些结果。结果清楚地显示，Fp细胞具有较高的促终末角质形成细胞分化能力，能够在体外重建皮肤模型内促进结构良好的表皮形态发生。

4.真皮网状层成纤维细胞的存在有效促进细胞外基质的产生：在真皮内，由真皮成纤维细胞产生和组织的细胞外基质分子非常重要。真皮细胞外基质蛋白和DEJ成分在含有Fr的体外重建皮肤模型内含量较高。Fr存在时，真皮的成熟和真表皮连接部基底膜更明显。免疫组织化学和mRNA结果证实，在含有Fr的体外重建皮肤模型中，Ⅰ型和Ⅲ型前胶原及糖胺聚糖链的沉积明显较高。这些结果证实，在体外重建皮肤模型中，相比Fp，网状层成纤维细胞有效参与主要细胞外基质分子如Ⅰ型和Ⅲ型胶原、蛋白聚糖(PG4)和原纤蛋白1的生成。

5.乳头层和网状层成纤维细胞释放MMPs和生长因子的相对特异性：如MMPs、细胞因子和生长因子等在细胞外环境中的释放能够维持皮肤的正常生理功能。使用ELISA或酶谱法分析分别由Fp和Fr构建的体外重建皮肤模型培养基内的可溶性因子。MMPs对真皮基质的降解起重要作用，并与其重构有关。Fp能够上调MMP1，而Fr能刺激MMP3的产生。含有Fp的重建皮肤培养基中的MMP1水平(mRNA和蛋白)是含Fr的2至3倍。MMP3的结果则完全相反。与Fp相比，Fr存在时 MMP2活性(酶谱分析)和mRNA MMP2表达水平较高。

分别检测含有Fp和Fr的体外重建皮肤培养基中血管内皮生长因子(VEGF)和角质形成细胞生长因子(KGF)。结果显示，含有Fp时，VEGF量是含有Fr的两倍。与此相反，与Fp相比，含有Fr时KGF呈双倍增长。

三、讨论

体外重建皮肤模型的使用可以更加详细地研究成纤维细胞在皮肤形态发生中的作用，因为此模型能够介导真皮成分中的既定成纤维细胞亚群而构成。该研究比较了乳头层和网状层成纤维细胞制备的两种体外重建皮肤模型。使用新鲜分离的Fr和Fp，首次证实了乳头层和网状层成纤维细胞在生长速率和胶原格收缩能力方面存在的差异，这是一个重要的先决条件。使用体外重建皮肤模型，将这些细胞类型放置在接近在体真实皮肤的3D环境中并加以比较，可以对其差异进行更进一步地研究。

研究结果显示，乳头层成纤维细胞，通过与表皮角质形成细胞相互“交流”，极好地促进了表皮的分层和终末分化，这或许如实地反映了在体相互作用的过程。该研究还显示，Fp具有较高的VEGF生成刺激能力，但是缺乏预期的产生真皮和DEJ的主要细胞外基质分子成分的功能，可能与网状层成纤维细胞的缺乏以及作为辅助因子对乳头层成纤维细胞的潜在影响相关。虽然Fp紧挨着表皮的DEJ，但该研究结果显示，在现有的体外重建皮肤模型实验条件下，与Fr的相互作用似乎是DEJ形成所必不可少的条件。

该研究还显示，在体内环境中活性较弱的网状层成纤维细胞在真皮细胞外基质成分及DEJ细胞外基质分子的生成上具有意想不到的活性。这或许是因为将其置于乳头层环境中，与表皮角质形成细胞的异常接近所致。网状层成纤维细胞对表皮角质形成细胞的影响也可以通过创伤愈合过程中特征性KGF的释放加以说明，很可能是所观察到的表皮终末分化受到轻微抑制的原因。KGF可诱导角质形成细胞的增殖，但会抑制其终末分化能力。KGF在Fr存在时高表达，可以解释在用Fr构建的模型中所发现的角质形成细胞分化延迟和基底层角质形成细胞数量相对增加的观察结果。Fp与Fr的功能性差异对人皮肤老化也具有重要意义，特别是真皮Fp亚群随年龄的增长而逐渐消失。这种可能性很重要，因为乳头层成纤维细胞被网状层成纤维细胞所替代可以导致KGF增加，进而造成表皮分层和分化的损伤。

总之，该研究结果证实，乳头层和网状层成纤维细胞具有独特且互补的作用。为了检验体外皮肤全层模型，今后的研究需进一步发展至使用乳头层成纤维细胞和网状层成纤维细胞两种亚细胞群组成的真皮替代物来重建皮肤模型，使得体外重建皮肤更接近在体皮肤细胞网络。

[陈旭 孔佩慧 甄雅贤 摘自 Eur J Dermatol，2012，22(3):324-332.]