椎间盘细胞增殖和分化的研究进展

刘书豪 费琴明

(复旦大学附属中山医院骨科，上海 200032)

椎间盘退化是导致椎间盘病变及腰部疼痛的主要原因之一。椎间盘退化的原因包括:髓核细胞的功能降低和数量减少以及蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白等基质成分的减少［1-2］;遗传因素、机体衰老以及椎间盘营养缺失、过度受压;椎间盘特殊的内环境如高渗、低氧、低营养、高酸性等［3-6］。现就椎间盘细胞增殖和分化的研究进展作一综述。

1 椎间盘细胞的起源和其在出生后的增殖过程

椎间盘细胞来源于胚胎时期的脊索，其在出生后不久，分化为脊索细胞和类软骨细胞。McCann等［7］用Noto-cre鼠来追踪脊索源性细胞，发现髓核细胞内的脊索细胞以及软骨样细胞均起源于胚胎脊索。Dahia等［8］对出生后不同时间小鼠椎间盘细胞增殖分化的情况进行了研究，他们用磷酸化组蛋白H3对椎间盘细胞进行染色，发现出生后2～3周内椎间盘细胞处于增殖状态，第1周达到峰值，3周后停止;而椎间盘细胞外基质在出生3周后仍继续增多，致使椎间盘体积不断增大;纤维环细胞在出生后1周内表现为围绕髓核的连续性结构，1周后这些细胞逐渐分化为连接相邻椎体的成熟纤维环细胞和覆盖椎体表面并最终形成终板的逐渐钙化的圆形细胞;TUNEL染色发现，出生后2周时髓核细胞及生长板细胞即发生凋亡，而钙化终板未发生凋亡。椎间盘伴随着椎体一起生长，其调控机制可能是一致的。

2 椎间盘干细胞的分化和干细胞龛

Risbud等［9］证实在人退化的椎间盘内存在骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。纤维环分离出来的细胞也被证实可以多向分化，甚至可分化为神经细胞和内皮细胞［10］。Blanco等［11］从人退化的椎间盘髓核中分离并扩增了MSC，通过流式细胞免疫表型检测、细胞分化、反转录-聚合酶链反应等技术证实，髓核MSC与自体的骨髓MSC在形态学、扩增潜能、免疫表型、分子谱和分化潜能上相似。Erwin等［12］从狗椎间盘髓核中提取并培养出祖细胞，发现其在体外可分化为软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞;在活体(髓磷脂缺乏鼠)内有分化为少突胶质细胞、神经元、星形胶质细胞的倾向，提示髓核祖细胞有用于神经修复的潜能。Huang等［13］对恒河猴的研究发现，在体外，髓核祖细胞的集落生成能力强于纤维环祖细胞;且其在体内(裸小鼠皮下移植模型中)或体外扩增后，仍有分化潜能。原代髓核祖细胞和传代髓核祖细胞有与骨髓MSC类似的分化能力，而纤维环祖细胞的分化能力相对弱于骨髓MSC。

人体多种组织都有干细胞龛，如肠、皮肤、脑等，干细胞龛的存在对相应组织细胞的扩增具有重大意义。Henriksson等［14］采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-Deoxyuridine，Brdu)标记法检测兔的椎间盘细胞增殖情况，发现在纤维环和髓核内有增殖细胞;髓核内增殖细胞极少，纤维环近骨外缘有少量持续增殖的细胞，而在近韧带区的纤维环外缘及软骨膜区有大量增殖细胞。前者被认为可能是椎间盘的干细胞龛，可能对椎间盘的形态和功能起重要作用;同时，Henriksson等对鼠、猪、人的椎间盘上进行了研究并证实了这一结论。他们还采用免疫组化手段对用BrdU进行体内标记的兔椎间盘进行观察，发现在肝细胞转移区域、BrdU标记区域都存在GDF-5、SMAD1/5、SOX-9细胞;此外，在这些区域还发现了SNAI1、SLUG和β1-INTEGRIN阳性的细胞，通过与小肠干细胞龛细胞的迁移进行对照，证实椎间盘内细胞增殖是由干细胞龛内细胞迁移引起的［15］。他们将MSC与椎间盘碎片共培养发现，炎性物质生成量下调。提示干细胞对减轻椎间盘炎症有积极作用［16］。

3 椎间盘细胞表面标志物

虽然干细胞龛被证实对促进椎间盘细胞增殖有明显效果，但其特异性标志物尚未被发现。目前多用各种软骨细胞及MSC标志物来定位和提取椎间盘有增殖分化能力的细胞。Brisby等［17］证实，在基因层面，OCT3/4、STRO-1、CD105、CD90和 Notch1在绝大多数退化的人体椎间盘标本中表达。Huang等［13］在mRNA层面发现，恒河猴椎间盘细胞普遍表达骨髓MSC的表面标志物如 CD44、CD166、CD90、CD146、HLA-DR、Notch1等，其中 CD146在髓核增殖细胞的表达量高于骨髓MSC和纤维环增殖细胞，提示CD146可能是髓核增殖细胞的特异性标志物［13］。Sakai等［18］提取并培养了 C57BL/6 鼠的尾椎间盘髓核细胞，得到两种集落群:黏附性成纤维细胞集落和球形集落;通过免疫组化染色发现，后者大量表达Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖，而前者不表达，因此他们认为，球形集落是髓核表型细胞;他们还发现，双唾液酸神经节苷脂(disialoganglioside 2，GD2)是与球形集落形成最为相关的表面标志物，且发现GD2+细胞的前体细胞是Tie+细胞;球形集落细胞在生长过程中呈现出如下变化:Tie2+GD2－CD24－(T/sp)细胞、Tie2+GD2+CD24－(TG/dp)细胞、Tie2－GD2+CD24－(G/sp)细胞，最后变为 Tie2－GD2－CD24+(24/sp)细胞。目前，寻找椎间盘干细胞特异性标志物仍是椎间盘基础研究的重点之一。

4 培养基质、椎间盘内环境、基础病因对椎间盘细胞增殖的影响

随着年龄增长，髓核内细胞不断减少，同时Ⅱ型胶原和蛋白多糖等细胞外基质成分也减少，而金属蛋白酶和胶原酶等含量增加。Brisby等［17］用骨髓-MSC细胞基质和非退化椎间盘细胞基质培养退化椎间盘的细胞，发现干细胞表面标志物的表达增加，说明MSC和椎间盘细胞产生的可溶性因子可以刺激退化椎间盘的修复过程［17］。He 等［19］通过滑膜源性干细胞获得其细胞外基质，将髓核细胞在此基质中培养，然后与无基质培养的髓核细胞进行比较，前者的扩增分化的能力显著强于后者;将在无基质环境下传代5次后的髓核细胞移到细胞外基质中进行第6次传代，发现其增殖和分化能力也提高了，说明已退化的椎间盘细胞在合适的基质中可恢复再生能力。

由于椎间盘内高渗、低糖、低pH值、高机械压力，植入椎间盘内的干细胞在短期内减少或死亡，更不能有效增殖与分化。Wuertz等［4］从不同年龄鼠中提取骨髓MSC，然后分别置于与椎间盘内糖含量、渗透压、pH值相同的环境下，发现在与椎间盘相同的低糖环境下，蛋白聚糖和胶原蛋白Ⅰ等生成增加，细胞也有少量扩增;但在与椎间盘相同的高渗环境和低pH环境以及三者都同的环境下，基质和细胞扩增都减少。Liang等［20］在对脂肪性源性MSC的研究中也得到了类似的结论。Li等［5］证实了在缺氧条件下，SD大鼠髓核MSC和骨髓MSC的活性及增殖能力减弱，但分化为软骨的能力增强。整体来说，髓核MSC比骨髓MSC更能耐受低氧环境。Tao等［6］将髓核细胞、髓核MSC在高渗环境下共培养，发现高渗环境抑制了细胞活性、增殖及分化，减少了基质的合成，但不影响凋亡率。因此，髓核-MSCs和髓核细胞共培养有望应用于椎间盘退化相关疾病的治疗。

此外，衰老、缺乏运动、遗传等基础病因也会导致椎间盘细胞增殖、分化能力的降低。Yasen等［21］从基因和蛋白表达层面上证实，兔椎间盘内增殖细胞和干细胞数量均随年龄的增长而呈降低趋势，椎间盘退变可能与椎间盘内增殖细胞和干细胞的减少相关。Sasaki等［22］通过对比运动组大鼠和对照组大鼠腰椎间盘细胞的扩增情况发现，运动组大鼠的腰椎间盘细胞在干细胞龛、纤维环内部和外围及骺软骨的外围区域均出现不同程度扩增，且运动可能对慢周期细胞和快周期细胞有促进作用。

5 生长因子对椎间盘细胞增殖的影响

在与椎间盘内氧含量相同的条件下，椎间盘细胞增殖速率在5 d后突然降低。体外髓核细胞不能适应低氧环境，被认为可能是低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)无法上调。低氧条件下，相对于无基质培养基，有蛋白聚糖时凋亡明显降低，而HIF生成增加。蛋白聚糖可能是通过与转化生长因子-β或BMP2信号系统相互作用而促进 HIF表达［13］。

椎间盘退化或创伤椎间盘细胞分泌的内源性生长因子增加或终板破坏、血管生成等原因导致外源性生长因子增加，两者激活了ERK和Akt通路，启动一系列磷酸化过程，进而使椎间盘内细胞增殖加快。Pratsinis等［23］证实，在体外血小板衍生因子、碱性成纤维生长因子、胰岛素样生长因子-I等可以通过MEK/ERK和PI-3K/Akt通路刺激人的椎间盘细胞扩增;同时，在模拟体内环境中也得到了相同的结果，并且发现自分泌生长因子可影响细胞扩增，并呈剂量依赖性。Sha’ban等［24］将纤维环和髓核细胞的可吸收多孔支架中加入纤维蛋白，发现其促进了细胞增殖和基质的形成。Shen等［25］发现，BMP-2通过转化生长因子-β/Smad信号通路在软骨细胞分化中起重要作用，同时还能促进软骨细胞基质的生成，因此，BMP-2也被用于对椎间盘细胞分化及基质生成等方面的研究。

6 椎间盘的外部干预

Lee等［26］研究发现，脉冲式电磁场对椎间盘细胞的扩增有刺激作用，但对蛋白多糖的合成以及软骨表型的表达无明显作用。

综上所述，本文从椎间盘细胞的起源、生长过程、干细胞龛、表面标志物等方面对椎间盘增殖分化的研究进行了总结，目的是探讨激发椎间盘细胞自我更新及再生分化潜能的方法，从而寻求椎间盘退化相关疾病的新的治疗策略。

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