依达拉奉对帕金森病大鼠模型的神经保护作用及黑质纹状体丙二醛和一氧化氮水平的影响

刘书芳

河南省漯河市中心医院神经内科，河南漯河 462000

帕金森病（PD）是当前医疗研究的热点之一[1]。氧化应激反应被认为是导致帕金森病的主要机制[2]。因此，保护机体神经组织并且尽量的防止氧化应激反应是帕金森病治疗的关键[3]。依达拉奉作为一种有效的抗氧化剂[4]，近年来我校以PD大鼠为对象，发现依达拉奉对PD大鼠的神经保护作用和黑质纹状体MDA、NO有一定的影响。现将有关结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料与仪器

成年健康雄性SD大鼠72只，体重（250±20）g，标准环境下饲养。抗坏血酸、阿扑吗啡、抗络氨酸羟化酶抗体、二氨基联苯胺（DAB）、6-羟基多巴胺（上述材料均由美国Sigma公司提供）；SABC试剂盒（北京中杉金桥公司提供）；丙二醛试剂盒、一氧化氮试剂盒（南京建成公司提供）；依达拉奉（先声东元公司提供）；BX50WI倒置显微镜（日本Olympus公司提供），MICRO4动物脑立体定位仪（美国WPI公司提供）。研究时间为2014年3月—2014年5月。

1.2 模型制作与动物分组

1.2.1 模型制作 选择60只大鼠制作PD模型。腹腔麻醉，固定在动物脑立体定位仪，沿中线切开2 cm切口，暴露前囟，确定左侧前脑内侧束位置和钻颅部位。钻开直径2 mm颅骨孔，微量进样器进针至靶点。约10 min后，注入6-羟基多巴胺4μL，浓度为2μg/μL，速度为9 ng/s。注射完成后留针10 min，然后退针。明胶海绵堵塞颅骨孔，青霉素常规消毒、缝合皮肤，然后放回笼中。

1.2.2 动物分组 12只大鼠为健康正常组（ZC），不作任何处理。12只大鼠为生理盐水组（YS），在PD模型制作完成30 min后，腹腔注射生理盐水1 mL，2次/d，连续14 d。另48只PD大鼠为实验组，在PD模型制作完成30 min后腹腔注射依达拉奉，浓度分别为0.3、1、3、3 mg/kg，记 0.3 mg 组、1 mg 组、3 mgA 组、3 mgB组。除 3 mgB组外，每日注射2次，持续14 d；3 mgB组持续28 d。

1.3 评价方法

1.3.1 旋转实验 ZC、YS、0.3g、1g、3gA 组在处理 14d、3gB 组在处理28d后腹腔注射阿扑吗啡，标准为0.5mg/kg。注射5min后持续记录30min。如PD模型大鼠在30min内旋转次数大于210次，为制模成功。如制模不成功，重复1.2制模和分组过程。

1.3.2 组织学方法 复合麻醉剂深度麻醉后，快速灌注生理盐水冲洗，然后快速灌注200 mL 4%甲醛，再缓慢灌注300 mL甲醛。断头取脑，置于4%甲醛，4℃冰箱固定4 h。然后依次置入20%、30%蔗糖磷酸盐缓冲液，4℃冰箱直至脑块沉入瓶底。取纹状体、中脑组织行冠状连续冰块切片，作尼氏体染色，计算黑质内尼氏体细胞数。

1.3.3 神经生化学检测 在大鼠断头后，快速取出大脑，分离出纹状体和中脑黑质，4℃生理盐水冲洗，滤纸拭干，置于-80℃超低温冰箱。称重后，剪碎组织块，置于冰浴玻璃匀浆器匀浆。然后按照丙二醛、一氧化氮试剂盒操作要求，测定丙二醛和一氧化氮活性变化。

1.4 统计学处理

所有数据使用SPSS 19.0进行统计学处理。计量数据采用均数±标准差表示。LSD法检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各处理对大鼠旋转次数与黑质内尼氏体细胞的影响

各处理对大鼠旋转次数与黑质内尼氏体细胞数的影响见表1。0.3mg、1mg、3mgA、3mgB 组旋转次数显著低于 YS组，但是高于ZC组（P<0.05）。各处理右侧黑质内尼氏体细胞数无统计学差异（P>0.05）。ZC组左侧尼氏体细胞数最高，其次为3mgA和3mgB组，YS、0.3mg、1mg组左侧尼氏体细胞数最少。

表1 各处理对大鼠旋转次数与黑质内尼氏体细胞数的影响

2.2 各处理对丙二醛和一氧化氮含量的影响

各处理对丙二醛和一氧化氮含量的影响见表2。黑质与纹状体中的一氧化氮和丙二醛含量均呈同一规律变化，ZC组的丙二醛含量与一氧化氮含量显著低于其他各组（P<0.05）。3 mgA组和3 mgB组则显著低于 YS、0.3mg和 1mg组（P<0.05）。

表2 各处理对丙二醛和一氧化氮含量的影响

3 讨论

氧化应激反应被认为是导致帕金森病的主要原因[5]。目前多巴胺是治疗帕金森病的主要药物。但是长期服用将会导致运动波动、精神症状等，而且疗效将会减退[6]。因此，急需寻找一种替代药物。依达拉奉可以转移电子，打破脂质过氧化反应链，实现神经细胞保护作用，同时也可以抑制氧化型细胞损害，防止血管内皮细胞损伤。另外，依达拉奉的亲脂基团还可以清除羟自由基，抑制过氧化作用。从本研究的结果来看，依达拉奉可以减少诱发后的旋转次数。尤其是随着处理浓度的增大，旋转次数明显降低。在本研究中，3mgA组、3mgB组30min旋转次数分别为 （210.13±9.56）、（206.42±8.81）次，显著少于 YS组、0.3mg组和 1mg组。上述结果揭示了依达拉奉可以改善PD大鼠的行为。本研究结果与成亚琴,陈鑫,张元媛等[6]结论是一致的。在他们的报道中，发现3mg/Kg处理可以有效的减轻大鼠旋转。他们认为这可能与DA神经元丢失减少、延缓了PD发展有关。从黑质体内尼氏体细胞数来看，各组右侧尼氏体细胞数并无明显差异，但是3mgA组和3mgB组左侧尼氏体细胞数显著少于ZC组，多于YS组和0.3mg组、1mg组，这揭示了左侧尼氏体细胞数对PD大鼠行为具有一定的保护作用。依达拉奉则可以提升PD大鼠左侧尼氏体细胞数。

一氧化氮和丙二醛被认为是过氧化反应的主要产物。从本研究的结果来看，注射依达拉奉后，虽然一氧化氮和丙二醛含量依然高于正常组（ZC），表明大鼠依然存在异常的过氧化作用，但是注射依达拉奉大鼠（3mg）的一氧化氮和丙二醛含量明显低于未注射依达拉奉大鼠（YS组）。不过研究发现，依达拉奉注射量抑制过氧化作用的效果存在差异。高剂量（3mg/kg）组的抑制效果显著好于低剂量组（0.3mg/kg、1mg/kg）。该结果表明了依达拉奉的使用剂量与过氧化抑制效果存在相关性。随着依达拉奉使用量增高，过氧化抑制效果越好。本研究结果与文献[5]、文献[6]的报道结论是一致的。在文献5、文献6的报道中，认为依达拉奉具有较强的氧化过激反应抑制作用。抑制氧化过激反应则是治疗PD的主要原则之一。

综合而言，对PD大鼠注射依达拉奉，可以较好的保护神经，改善大鼠行为，抑制一氧化氮和丙二醛生成，防止机体过氧化作用，揭示了依达拉奉在帕金森病的治疗中具有重要的价值。但是本研究结论是基于大鼠实验，目前有关于人体试验的报道尚未见到。依达拉奉是否对PD患者具有效果、具体的剂量、使用方法等都还是空白。这需要在以后进一步深入。

[1]熊珮,陈忻,张楠.帕金森病病理机制及中药防治帕金森病实验研究进展[J].中国中药杂志,2012,37(5):686-691.

[2]张美蓉,孙芳玲,艾厚喜,等.帕金森病的炎症及抗炎药物的研究进展[J].中国康复理论与实践,2012,18(11):1040-1043.

[3]陈鑫,成亚琴,施建生,等.依达拉奉对6-OHDA诱导的帕金森病大鼠黑质纹状体神经元的保护作用[J].江苏医药,2013,39(7):779-782.

[4]黄月,赵青赞,任秀花,等.依达拉奉对脂多糖诱导的PD大鼠模型神经保护作用的实验研究[J].中风与神经疾病杂志,2011,28(1):53-54.

[5]吴二兵,陈鑫,张元媛,等.依达拉奉对6-OHDA诱导的帕金森病大鼠黑质纹状体MDA、NO含量的影响[J].中风与神经疾病杂志,2013,30(9):781-784.

[6]成亚琴,陈鑫,张元媛,等.依达拉奉对帕金森病大鼠模型的神经保护作用及黑质纹状体丙二醛和一氧化氮水平的影响[J].临床神经病学杂志,2013,26(4):282-285.