麻风免疫诊断进展

吴勤学 王洪生

·综述·

麻风免疫诊断进展

吴勤学 王洪生

本文系统地复习了麻风杆菌(ML)基因组诠释前后的免疫诊断研究，诠释前的研究主要包括以PGL－I为基础的血清学实验和以蛋白抗原为基础的血清学实验，诠释后的研究主要介绍了培养滤液蛋白CFP－10和早期分泌抗原在免疫诊断中的应用，还介绍了特异性引起T细胞反应的肽类的研究。

麻风杆菌； 免疫诊断

目前早诊断与早治疗依然是控制麻风的基石，涂片查菌阳性率低和缺乏特异性延迟了麻风早期诊断及治疗。免疫诊断一直是研究的热点，但因多菌型(MB)麻风细胞免疫力缺陷，体液免疫力与正常人接近，而少菌型(PB)与MB相反，造成免疫检测困难。另ML抗原大多与结核杆菌(Mtb)、非结核杆菌(NTM)有交叉反应，也限制了免疫诊断的发展。通过多年的研究，发展了许多方法并加以改进，特别是在ML基因组揭密后。

1 ML基因组诠释前的免疫诊断研究

1.1 血清学实验

1.1.1 酚糖脂(phenolic glycolipid I，PGL－I)为基础的实验 1981年Hunter和Brennan发现了ML特异抗原PGL－I，IgM类抗体对其末端三糖是特异性的，与Mtb，M.kansasii，M.avium，M.intracellulare感染没有交叉反应，但由于ML体外不能培养，PGL－I的来源是个问题，加之PGL－I分子的脂质无极性，使PGL－I包被到微量滴盘非常困难。为克服上述问题，1987年Fujiwara等成功地合成了这个末端三糖，从此麻风血清学实验采用这种半合成的抗原。现在应用最广泛的是天然的二糖与BSA连结(通过Octyl臂)的ND－O－BSA和天然三糖与BSA连结(通过phenyl臂)的NT－P－BSA抗原建立的ELISA，即:ND－O－BSAELISA和NT－P－BSA－ELISA。特别是ND－O－BSAELISA经吴勤学等1进一步最适化研究，不但提高了敏感性，还节约了近10倍的抗原，并可用来预测麻风复发的可能性。Izumi等与Fujirebio协作开发了一种简单的Serodia leprae(即颗粒凝集实验)，可定性和定量检测抗PGL－I抗体水平。我国吴勤学等亦建立了胶乳凝集实验，2这两种实验不需昂贵设备，结果与ELISA平行，且可用滤纸法收集血标本。经吴勤学等系统评价认为优化后的ND－O－BSA－ELISA目前为最佳，1明显提高了诊断的敏感性和特异性，但检测少菌型病例仍达不到100%。1998年Bahrer－Sekula开发和评价了蘸棒实验(dipstick test)，3小时内即可检出抗ML的IgM类抗体，与ELISA的符合率为97.2%，亦能检测患者复发的可能性。该实验后来又进一步改为ML flow test(ML明窗实验)，能在10分钟内检出抗体，可用于麻风分类和检测接触者患病的危险性，但其敏感性依然低于ND－O－BSA－ELISA。

1.1.2 蛋白抗原为基础的血清学实验 随着基因工程的发展与应用，许多ML的蛋白可以克隆和表达，除35kD蛋白外，大都为热休克蛋白(HSP)。HSP广泛分布于真核与原核微生物中，且多与人的HSP有交叉反应(即有共同的序列)，许多交叉反应特异决定簇与Mtb有交叉反应。3尹跃平等4报道α2蛋白未发现与人的HSP有交叉反应。

1.1.3 35kD蛋白为基础的血清学实验 本抗原是用ML特异的单克隆抗体(Mab)鉴定出来的，后来Roche等5简化为快速免疫层析卡实验(rapid immuno－chromatographic card test)。此方法与直接ELISA(35kD)和PGL－I(ELISA和蘸棒实验)比较时发现其快速且结果符合。但本法缺乏特异性，不能用于麻风早期诊断。

1.2 血清学免疫法应用的研究

1.2.1 用于麻风诊断 Roche和Bach等证明麻风抗体的产生与细菌指数(BI)相关。5，6吴勤学的结果亦表明血抗麻风杆菌IgM类抗体的水平与BI呈线性相关。7国外许多研究显示，抗体在MB 75%～100%为阳性，在PB 15%～40%为阳性，在PN(纯神经炎类) 50%为阳性。8，9吴勤学报道抗体阳性MB＞95%，PB为80%。1研究还发现PB中抗体阳性者畸残等级高。10，11血清学方法结合皮损数诊断可减少皮损少于6块的MB的分类误差，使分类误诊率减少9%，对血清学阳性的患者予以治疗可减少不适当治疗的产生，12但鉴于PB 60%和PN 50%的漏诊率，尚不能用血清学方法作为单独的诊断实验。

在MB 95%Leprosy IDRI Diagnostic(LID)－1蛋白抗原的IgG类抗体阳性。检测MB家庭接触者的研究发现，在发病前1年，64%的IgG＋者反应增强，且早于PGL－I IgM，可用于早期检测，在感染的犰狳中显示若联合LID－1和ND－O－BSA更适于早期诊断。13LID－1 IgG抗体在治疗过程中比PGL－I IgM抗体下降快，可能是由于蛋白的清除比脂质快。LID－1的IgG抗体在已被治疗者中不存在或水平极低，未治疗者很高，说明该抗原可以检测治疗效果或复发。王洪生等评价MMP II－ELISA和ND－O－BSA－ELISA显示前者略优于后者。ML2028(Ag85B)和ML2038(菌转铁蛋白)也可以检测大多PB中的抗体。

1.2.2 在普通人群和家内检测接触者 与正常普通人群相比，麻风接触者患麻风的风险增加，但并不是所有研究都显示接触者的血清阳性率均高于正常普通人群。吴勤学等研究显示麻风IgM类抗体水平呈“波纹现象”，即家内接触者＞近邻＞普通人群。14总体人群监测发现亚临床感染率高于发病率，评价者在流行区检测到阳性率为1.7%～31%。PB检测IgM类抗体大部分为阴性，不能用于人群筛选，故血清学实验尚不能用做单一的诊断实验，但可用于:为治疗目的区分MB和PB；15－17早期预测复发或发病；15，18在高危人群中(如接触者)发现发病危险者，MB接触者中PGL－I抗体阳性者发病危险比阴性危险高8倍以上；13，15，19，20在可行范围内随访治疗。15

1.3 皮肤实验

1.3.1 早期皮肤实验抗原 对分枝杆菌的免疫反应，无论麻风还是结核，主要是细胞免疫反应。Mitsuda报道某些人类个体(含麻风患者)注射瘤型麻风患者组织悬液能产生局部结节反应。称为麻风菌素实验。1942年Dharmendra用氯仿和乙醚将多菌的麻风瘤提取去脂ML，皮内注射此制剂24～48小时后仅产生“早期反应”。该抗原经Sengupta进一步标化能引起早期和晚期反应。ML从犰狳获得后，能从经放射杀死的提纯的ML超声物中制取可溶性抗原，随后离心除去细胞壁，标化浓度为1 mg蛋白/0.1 mL，即Rees抗原；或将放射杀死的ML裂解，随之用过滤法除去细胞壁并校正蛋白为0.5mg/mL，即Convit抗原，两种抗原均能引起早期反应。麻风菌素实验不能区别患者与健康者，且不同批麻风菌素皮肤反应的大小亦有所不同。

1.3.2 新皮试抗原 MLSA－LAM:用去污(垢)剂除去犰狳来源的ML的LAM和脂质；MLCWA:用提取细胞壁法获得的ML细胞壁抗原。两种抗原正在尼泊尔作II期临床实验，以鉴别哪种抗原成分在起作用。

2 麻风杆菌基因组诠释后的新诊断抗原的研究

ML在2000年完成基因组测序。其基因组在演化过程中逐渐退化，形成1116个无功能的伪基因，1614个蛋白编码基因，从而丧失了许多重要代谢活性。RDL(Region of Divergence)区在BCG中失去，但在Mtb中仍然保留，所以两者可区别。在失去的抗原中有两个低分子量的蛋白，即培养滤液蛋白CFP－10 (culture filtrate protein 10)和早期分泌抗原靶蛋白(early secreted antigenic target，EAST－6)。

2.1 CFP－10 来源于Mtb，为免疫优势10 kD蛋白抗原，在Mtb感染的小鼠和人来源的T细胞能引起早期IFN－γ反应。从培养上清中IFN－γ的分泌可探知T细胞反应，有防止分枝杆菌感染的免疫能力(因为IFN－γ是Th1型细胞因子)。ML的CFP－10 (ML0050)基因位于Mtb基因组的RD1同序部分。研究表明在蛋白水平与Mtb的RD1中仅有40%同序，有可能发展成特异诊断麻风的一种T或B细胞反应抗原。用不交叉的部分重组的短肽有区别Mtb和ML的潜力。抗ML CFP－10(证明也是一种10 kD分泌蛋白)系用重组法获得，其在BI阳性的麻风患者血清阳性率为83.3%，在BI阴性的麻风患者血清阳性率为18.4%，与受试的非TB、健康对照及其他皮肤病个体无交叉反应。统计学上，IgG抗体实验与PGL－I具有可比性。

2.2 ML ESAT－6抗原 存在于Mtb中，为一种6 kD蛋白，在BCG中不存在。ML ESAT－6(ML0049)，在与上述相同的operon中发现，能被麻风患者T细胞识别，与Mtb有36%的交叉反应。重组不交叉的短肽P4和P9后，发现其杂交克隆单克隆抗体与Mtb无交叉反应。Parkash的研究显示ESAT－6和CFP－10在早期检测和监测麻风治疗中有作用。20总之，MLCFP－10和ESAT－6在结核流行率高的地区诊断ML具有局限性。

2.3 主要膜蛋白I(Majormembrane protein I)(MMP I) MMP I是一种粗制的35 kD蛋白，在TT患者引起强T细胞反应，重组的ML 35 kD在PB患者和接触者中引起T细胞增多，且与Mtb无交叉反应。但与M.avium有交叉反应。研究表明有4种肽(P60－76，P132－151，P206－224，P269－286)可能为ML特异肽。

2.4 MMP－II 为一种分枝杆菌转铁蛋白，分子量为380中kD，在氨基酸水平与Mtb和M.avium的同序性为86%。用ELISA检测抗体发现在PB和MB均显示可作为一种诊断标志，但需扩大样本以排除环境分枝杆菌的干扰。21

2.5 GroES 10 kD热休克蛋白 系分子量为10～12 kD的蛋白，存在于ML和Mtb中，两者间有90%的同序性，与E.coli的GroES hsp有44%同序性。ML的25－40序列肽与HLA－DRB5∗0101有最强的亲和性，可发展成为一种血或皮肤实验，用于诊断TT。

2.6 45 kD蛋白 45 kD蛋白系一种富含氨基酸的抗原。尽管与Mtb有一定的同序性，但曾描述为一种ML的特异抗原，但在英国及巴基斯坦的研究中表明仍存在交叉反应。

总之，第一代抗原，含有丰富的ML抗原，但主要的问题是与Mtb、环境分枝杆菌有交叉反应，另MMP－II值得进一步研究与评价。

2.7 特异性引起T细胞反应的肽类的研究 原先已发现ML的70 kD、65 kD、35 kD、18 kD和10 kD抗原在TT病人可诱导T细胞反应。这些热休克蛋白家族有高度的保守性，而且ML的70 kD、65 kD和10 kD抗原显示与Mtb的同源性达90%，所以均不能用于麻风的诊断。鉴于此，Dockrell等22利用ML的基因组信息去鉴别ML特异的能在麻风患者中引起T细胞反应的肽类。特选产生有效T细胞反应的HLA－DR连接部分，用FINDPATTERNS程序进行筛选(与Mtb的序列差异性用FASTA程序)，发现8种肽在TT患者和健康的麻风接触者中显示特异性。Cole等23比较ML和Mtb的基因组，发现165个ML基因与Mtb基因无同序性，已发现其中29个有功能。以上述的知识为基础，Geluk等24找到19个有潜力的诊断麻风的抗原(12个ML特异蛋白，5个与其它分枝杆菌有同源性)，选择的依据是:分子量大小；是否存在于HLA－II类连接部分；其在巴西麻风患者、家庭内接触者、TB及健康个体中IFN－γ产生与否。有5种抗原(ML0576，ML1989，M1990，M2283，M2567编码的)显示在细胞免疫和体液免疫检测方面有一定意义，但这些抗原与Mtb及环境分枝杆菌的交叉反应尚未排除，是否真的对ML特异，还有必要进一步发掘除IFN－γ之外的细胞因子。25Spencer等26对4种重组蛋白和58种合成肽(从26个ML开放阅读框架选出的，推测与人HLA－DR或HLA－I类分子连接)的研究结果发现肽P67，P68，P75，P91和P92有诊断潜力，但需扩大样本加以确定。Aráoz等27用生物信息和比较基因学技术鉴定有诊断意义的蛋白抗原。当用细胞免疫法和ELISA法研究它们的意义时，仅发现2个蛋白(ML0308，ML2498)显示了明显的体液和细胞免疫原性，提供了特异诊断PB和MB的可能性。

3 小结与思考

综上所述，麻风免疫诊断自发现麻风菌特异抗原PGL－I以来取得了相当大的进展，但以PGL－I为基础的各种实验在PB中阳性检测率仅20%～40%(有报道达80%者)，因此需要进一步研究和鉴别新的敏感性更高的抗原，特别是包括能早期预测麻风反应的抗原。麻风基因组揭秘后，近200种重组的单体蛋白被发现能用于麻风的早期诊断。以往国内外学者一致认为诊断麻风的实验必须达2个100%(100%的敏感性和100%的特异性)。特提出如下思考:将现有经过比较评价后的最有价值的方法进一步最适化处理，最大限度地提高其敏感性和特异性。鉴于有许多因素影响受试对象的MHC对混合抗原个体成分的反应。如:(1)基因(遗传)组成(MHC多态性)，一种受试的肽是否能被MHC分子提呈；(2)个体的免疫状态(如HIV＋或疾病引起无免疫反应能力)；(3)在感染期间(过程中)T细胞对特殊抗原反应波动(这对PB和MB来讲是很重要的因素)。因此，设计一个高度敏感性和特异的麻风诊断实验应将多种抗原或肽类拼成混合物或做为一种多聚蛋白，这可增加反应性。同样可联合多种肽而做成高敏感和特异的细胞免疫实验早期和快速诊断麻风；将现有的方法按不同目的需要加以串联、并联、组合提高其特异性和敏感性亦是有价值途径。

目前不但已重启以PGL－1为基础的实验(如PGL－1－ELISA、ND－O－BSA－ELISA等)而且相关协作研究在WHO资助下已开展，如IDEAL(Initiative for Diagnostic and Epidemiological Assays for Leprosy)已于荷兰首都阿姆斯特丹建立。目前正在用IFN－γ实验组合重组蛋白(包括某些融合蛋白)选择新的抗原，试图改进血清诊断方法建立敏感和特异的麻风诊断实验。

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2Wu QX，Ye GY，Yin YP，et al.Rapid serodiagnosis for leprosy－a preliminary study on latex agglutination test.Int J Lepr，1990，58(2):328－333.

本文主要针对IoT平台中存在的数据安全性差和传输验证效率低的问题展开了研究和分析，并提出使用区块链技术来解决上述问题。体域网作为IoT的一部分，将其与区块链技术相结合实现身份认证，是本文的研究重点。通过研究发现：数据能够有效地实现防恶意用户或者服务器的篡改，保证数据的分散性，符合现实生活对数据存储的需求；数据间的传输、加密、验证过程不再需要过于冗杂的计算，提高了数据操作过程中的计算效率，节约了计算开销。与此同时，如何保护在公共信道中的公钥不被他人用于共谋攻击等问题，仍需要日后解决。此外，随着IoT平台的进一步发展，区块链技术实际应用于智能医疗、智能家居等实际场景中将是未来发展方向。

3 Sengupta U.Recombinant antigen:current situation and future. Int J Lepr，1999，71(1):111－120.

4Yin YP，Wu QX，HouW，etal.Preparation of recombinantα2antigen of M.leprae in E.Coliand the application for sero－diagnosis of leprosy.Chin Med Sci J，1999，14(2):106.

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(收稿:2013－06－28)

Immunodiagnosis of leprosy

WU Qin-xue，WANG Hong-sheng.Institute of Dermatology，Chinese Academy ofMedical Sciencesand Peking Union Medical College，Nanjing，210042

This paper systematically reviewed immunodiagnosis of leprosy before and after genomic research.The tests before genomic researchmainly include phenolic glycolipid(Phenolic glycolipid I，PGL－I) and protein antigen serology experiment.The tests after genomic researchmainly include the application of culture filtrated protein 10 and EAST－6 in serology and peptides which cause specific T cell responses.

M.Leprae；immunodiagnosis

中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所，南京，210042