骨髓单个核细胞在周围神经修复中的应用

陈琳 黄红云 敖强 左焕琮 张玉琪

骨髓单个核细胞在周围神经修复中的应用

陈琳 黄红云 敖强 左焕琮 张玉琪

基础研究证实，多种细胞移植可以促进周围神经修复，其中来源丰富的骨髓单个核细胞，因具有取材过程简单、无交叉感染风险、无免疫排斥、可以自体移植等诸多优点，是目前重要的候选细胞之一。本文就近期有关骨髓单个核细胞的神经修复作用机制的研究、细胞植入修复受损周围神经的文献、以及与各种生物材料复合应用构建的组织工程化神经等方面最新进展进行综述，以期促进该领域基础向临床应用的转化。

骨髓；单核细胞；周围神经；损伤；细胞移植；导管

近年来，基于细胞移植的疗法已成为一种很有前途的干预手段。雪旺细胞（schwann cell，SC）是周围神经再生的主要支持细胞，但需要克服自体雪旺细胞来源不足等临床应用的限制。在此背景下，来源丰富的骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cell，BM-MNC）已被作为替代，用于治疗周围神经病变，一些研究已经试图揭示BM-MNC促进神经再生的机制。为了更清楚的了解BMMNC在粗大神经组织的再生修复作用效果，使其作为临床可行手段[1]，笔者就骨髓单个核细胞在周围神经修复中的应用作一综述。

一、概述

1997年，Prockop等[2]从人骨髓中分离得到BM-MNC，在体外不同的诱导条件下，可分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，证明了BM-MNC的多向分化潜能。

许多动物骨髓中都存在一定数量的BM-MNC，从骨髓中分离BM-MNC的方法主要有：(1)差速贴壁筛选法；(2)密度梯度离心法；(3)流式细胞仪分选法；(4)免疫磁珠分离法。目前应用比较广泛的是差速贴壁筛选法结合密度梯度离心法。获得的BM-MNC纯度可达到95﹪[3]。

BM-MNC是一簇具有多种细胞多向分化潜能的细胞，同时又具有可塑性，在一定的条件下可向不同方向分化及去分化。BM-MNC可以表达CD13、CD29、CD44、CD84、CD71、CD90、CD105、CD106、CD120a和CD124等，这些黏附分子是其重要表面标记，但不表达造血细胞表面抗原，如CD1a、CD31、CD34（造血干细胞标志抗原）、CD14（单核/巨噬细胞表面抗原）、CD45（白细胞标志抗原）以及CD5A等[4-6]。目前，仍未筛选到BM-MNC中骨髓基质细胞（bone marrow stromal cell，BMSC）上特有的标记分子，尚无直接方法可进行鉴定。各实验室鉴定方法都是通过在培养过程中出现分化表型，然后逆推得知是否为骨髓基质细胞。

二、神经修复作用机制

将BM-MNC移植到体内，在损伤微环境的刺激下，BM-MNC能分泌多种神经营养因子，如神经生长因子 (nerve growth factor，NGF)、睫状神经营养因子 (ciliary neurotrophic factor，CNTF）、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、胶质细胞系来源的神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、I型 和IV型胶原、纤维连接素、层粘连蛋白等细胞外基质，并由损伤微环境产生的因子及其相关受体诱导BMMNC分化为雪旺样细胞而发挥作用[7-9]。神经再生过程的早期和晚期都伴随有神经营养因子的高表达。局部环境的生长因子、细胞因子和局部的干细胞可能作用于此过程。

作用机制包括：（1）分泌各种细胞因子、营养因子[7]；（2）促进血管再生、重建血管功能[10]；（3）抑制神经元凋亡；（4）免疫调控；（5）直接替代、能分化为神经类细胞修复；（6）促进内源性细胞增殖；（7）促进轴突再生、再髓鞘化[11]。

三、BM-MNC的周围神经修复研究

最近的数年，骨髓单个核细胞（BM-MNC）在神经再生的作用获得广泛研究。使用BM-MNC的优点：过程微侵袭、自体骨髓来源丰富、无交叉感染风险、无伦理问题、无需使用免疫抑制剂、以及无成瘤风险等。研究者采取不同形式移植BM-MNC。

2009年，Goel等[12]直接移植BM-MNC坐骨神经两个断端，帮助髓鞘形成（提高有髓神经纤维的比例和髓鞘的厚度），轴突再生，缓解退变。BMMNC也可以混合纤维蛋白胶使用，这种细胞能嵌入在纤维蛋白胶存活，并分泌生长因子，如NGF和BDNF。当BM-MNC-纤维蛋白胶注射在移植物内部和周围，可以观察到修复SD大鼠15 mm的坐骨神经缺损[13]。3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯（poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)， PHBHHx）和人骨髓单个核细胞（hMSC）复合，可以修复SD大鼠10 mm坐骨神经损伤模型，轴突再生良好[14]。

显然，很多证据表明，BM-MNC当被移植到病灶部位，具有一定的支持神经再生的能力，虽然其机制尚不完全清楚，但有理由推测，在神经病变微环境特定因素作用下，移植的细胞可以被诱导分化为功能性雪旺细胞样细胞[15]。Cuevas等[16]报告将BMMNC置于神经损伤的微环境中，它可以表达多种营养因子和它们的受体，并易于向雪旺细胞系分化。

在组织工程化神经移植研究中，分化的BMMNC可能是一种有前途的细胞来源。BM-MNC可被诱导分化成的具有雪旺细胞样特性的细胞，有髓鞘形成能力和分泌神经营养因子。2001年，Dezawa等[17]证实大鼠的坐骨神经再生，可以被体外诱导分化的BM-MNC来源的髓鞘化细胞促进。2004年，Mimura等[18]也从BM-MNC诱导成功雪旺样细胞，修复成年大鼠坐骨神经。Wang等[19]证实这种细胞能桥接修复大鼠15 mm长的坐骨神经缺损。

虽然基因修饰和体外定向诱导分化的细胞，可能分泌更多生物活性因子，如BDNF、NGF[20]，或更优良的成鞘性，但从目前国内外政府医疗政策管理角度和临床安全转化医学的迫切角度，原代自体BM-MNC更利于更快向临床应用转化，满足患者迫切的治疗需求。

四、BM-MNC与多种生物材料复合应用最新研究

BM-MNC与生物材料构建组织工程神经已成为研究热点[21]。将BM-MNC原代或体外培养扩增分化的SC样细胞种植到神经导管中，可促进周围神经再生[22]。

研究表明，脱细胞神经移植物，往往不足以替代自体移植，供长距离周围神经缺损的修复。而脱细胞同种异体神经移植物，具有生物活性和神经突促进因子，在复合植入BM-MNC后，可以显示出协同作用[23]。Liao等[24]报告使用未分化的MSC复合脱细胞动脉导管，可以提高再生轴突的密度，加速萎缩肌肉恢复。Nijhuis等[25]采用填充小块新鲜肌肉的方法，以防止静脉导管塌陷，然后管道中充满BM-MNC，证实可以桥接修复15 mm大鼠坐骨神经缺损。

Hu等[26]选取恒河猴（非人类灵长类动物）为实验对象，用壳聚糖/PLGA为基础，与MSC复合构建组织工程化神经，桥接移植猕猴50 mm长的正中神经缺损，12个月后，证实安全有效。

使用聚己内酯（polycaprolactone，PCL）神经导管，管内充满修复细胞是一个很好的促进神经再生策略。Frattini等[27]选取小鼠坐骨神经再生和神经元存活为测试对象。C57BL/6小鼠的左侧坐骨神经被横断（3 mm间隙），其神经断点桥接植入生物可降解PCL管（MSC注入充填）。运动功能根据坐骨神经功能指数（sciatic nerve functional index，SFI）进行分析。6周后，处死动物，收集再生的坐骨神经、背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）、以及脊髓和腓肠肌。再生神经的定量分析表明，有髓纤维数量显著增加。MSC治疗组中，DRG神经元的数目显著增高，虽然脊髓的运动神经元数量无明显差别。还发现营养因子特别是NGF，在MSC组高表达。SFI揭示MSC治疗组有显著改善。腓肠肌显示质量增加和肌酸磷酸酶的水平提高，表明神经再支配。免疫组化证明，部分移植细胞表达雪旺细胞样表型（S-100蛋白阳性）。

McGrath等[28]构建纤维蛋白胶导管含有纤维蛋白基质及MSC，浓度80×106个细胞/ml，修复大鼠坐骨神经10 mm缺损。在联合环孢素A时，MSC在导管存活更好，并明显增强轴突再生，另外，排除环孢素A的作用，MSC移植的导管可以显著降低ED1阳性巨噬细胞的反应。该研究采用自体细胞移植，未使用环孢素。

在相关条件下，BM-MNC能够分化成不同类型的细胞，包括雪旺样细胞。壳聚糖凝胶海绵是有效的促进大鼠坐骨神经轴突再生的支架。骨髓单个核细胞来源的雪旺样细胞与壳聚糖凝胶海绵复合，修复8 mm大鼠外周神经缺损。免疫组织化学显示，在术后7 d，再生轴突附近发现移植的雪旺样细胞，术后14 d延长到宿主远端神经节段。电子显微镜显示，在移植后1个月，雪旺样细胞在再生轴突周围形成髓鞘，有髓神经纤维的直径增加[29]。

Hsu等[30]构建层粘连蛋白（laminin，LN）改良的壳聚糖多壁神经导管，种植BM-MNC桥接SD大鼠的10 mm坐骨神经缺损。术后16周免疫组化证实，LN显著提高了细胞黏附。新生神经充满导管的内部，成功连接神经缺损。在神经再生、腓肠肌肌肉质量、功能恢复和示踪方面，植入复合骨髓单个核细胞导管的大鼠效果最好。辣根过氧化物酶示踪分析表明，腰脊髓的运动神经元的数量和信号强度均显著提高。此外，骨髓单个核细胞抑制神经细胞死亡，并可抑制因壳聚糖长期植入引起的炎症和纤维化反应。

新近，有研究采用自体BM-MNC复合聚（乳酸-共-乙 醇 酸）（poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA）-壳聚糖导管构成组织工程神经，能桥接修复犬50～60 mm长坐骨神经缺损，值得关注和深入研究[31-32]。

壳聚糖和BM-MNC的组合有望改善神经再生修复，可以被用来作为一种替代传统的神经自体移植的一种潜在有效方法。研究证实，壳聚糖导管内植入骨髓单个核细胞，可以修复8 mm成年大鼠坐骨神经缺损。术后6周，坐骨神经功能指数（SFI）、平均再生纤维密度、纤维直径均达到类似于自体神经移植的效果[33]。我们最近的研究进一步证实，壳聚糖和BM-MNC组合，对大型动物山羊的长距离（30 mm）腓总神经缺损也有较好修复效果。

总之，应用BM-MNC及其与多种支架构建的组织工程化神经，修复周围神经损伤虽已取得了一些可喜的成果，但还有许多亟待解决的问题：（1）当前选用的动物模型主要以啮齿类小型动物为主，难以接近模拟人的临床实际；（2）神经损伤导管桥接再生，功能还不能获得更高程度的恢复；（3）长段或多根周围神经损伤的修复，需要更理想的组织工程化神经；（4）对于直径更粗大的神经，如何提高修复效果？

1 Oliveira JT,Mostacada K,de Lima S,et al.Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for improving nerve regeneration[J].Int Rev Neurobiol,2013,108:59-77.

2 Prockop DJ.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues[J].Science,1997,276(5309):71-74.

3 朱奇,顾晓松.骨髓间充质干细胞在周围神经再生中的应用[J].解剖学杂志,2008,31(2):265-268.

4 华松,武浩,赵慧英,等.山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及向神经细胞诱导分化的研究[J].安徽农业大学学报,2004,31(3):273-277.

5 Tondreau T,Lagneaux L,Dejeneffe M,et al.Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: Phenotype,proliferation kinetics and differentiation potential[J].Cytotherapy,2004,6 (4):372-379.

6 Baddoo M,Hill K,Wilkinson R,et al.Characterization of mesenchymalstem cells isolated from murine bone marrow by negative selection[J].J Cell Biochem,2003,89(6):1235-1249.

7 Choi García R,Aguiar J,Alberti E,et al.Bone marrow stromal cells produce nerve growth factor and glial cell line-derived neurotrophic factors[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,316(3):753-754.

8 Wakao S,Hayashi T,Kitada M,et al.Long-term observation of auto-cell transplantation in non-human primate reveals safety and efficiency of bone marrow stromal cell-derived Schwann cells in peripheral nerve regeneration[J].Exp Neurol,2010,223(2):537-547.

9 Madduri S,Feldman K,Tervoort T,et al.Collagen nerve conduits releasing the neurotrophic factors GDNF and NGF[J].J Control Release,2010,143(2):168-174.

10 Fernandes M,Valente SG,Fernandes MJ,et al.Bone marrow cells are able to increase vessels number during repair of sciatic nerve lesion[J].J Neurosci Methods,2008,170(1):16-24.

11 Chen CJ,Ou YC,Liao SL,et al.Transplantation of bone marrow stromal cells for peripheral nerve repair[J].Exp Neurol,2007,204(1):443-453.

12 Goel RK,Suri V,Suri A,et al.Effect of bone marrowderived mononuclear cells on nerve regeneration in the transection model of the rat sciatic nerve[J].J Clin Neurosci,2009,16(9):1211-1217.

13 Zhao Z,Wang Y,Peng J,et al.Improvement in nerve regeneration through a decellularized nerve graft by supplementation with bone marrow stromal cells in fi brin[J].Cell Transplant,2014,23(1):97-110.

14 Sakar M,Korkusuz P,Demirbilek M,et al.The effect of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) (PHBHHx)and human mesenchymal stem cell (hMSC) on axonal regeneration in experimental sciatic nerve damage[J].Int J Neurosci,2014,124(9):685-696.

15 Wang H,Zhang H,Liu M,et al.Distal segment extracts of the degenerated rat sciatic nerve induce bone marrow stromal cells to express Schwann cell markersin vitro[J].Neurosci Lett,2013,544:89-93.

16 Cuevas P,Carceller F,Garcia-Gomez I,et al.Bone marrow stromal cell implantation for peripheral nerve repair[J].Neurol Res,2004,26(2):230-232.

17 Dezawa M,Takahashi I,Esaki M,et al.Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells[J].Eur J Neurosci,2001,14(11):1771-1776.

18 Mimura T,Dezawa M,Kanno H,et al.Peripheral nerve regeneration by transplantation of bone marrow stromal cell-derived Schwann cells in adult rats[J].J Neurosurg,2004,101(5):806-812.

19 Wang Y,Zhao Z,Ren Z,et al.Recellularized nerve allografts with differentiated mesenchymal stem cells promote peripheral nerve regeneration[J].Neurosci Lett,2012,514(1):96-101.

20 Kim S J,Choi S W,Hur K J,et al.Synergistic effect of mesenchymal stem cells infected with recombinant adenovirus expressing human BDNF on erectile function in a rat model of cavernous nerve injury[J].Korean J Urol,2012,53(10):726-732.

21 Wang D,Liu X L,Zhu J K,et al.Bridging small-gap peripheral nerve defects using acellular nerve allograft implanted with autologous bone marrow stromal cells in primates[J].Brain Res,2008,1188:44-53.

22 王长辉,李德华.骨髓间充质干细胞修复坐骨神经损伤的研究进展[J].生物医学工程学杂志,2010,27(5):1193-1196.

23 Pang CJ,Tong L,Ji LL,et al.Synergistic effects of ultrashort wave and bone marrow stromal cells on nerve regeneration with acellular nerve allografts[J].Synapse,2013,67(10):637-647.

24 Liao IC,Wan H,Qi S,et al.Preclinical evaluations of acellular biological conduits for peripheral nerve regeneration[J].J Tissue Eng,2013,4:2041731413481036.

25 Nijhuis TH,Bodar CW,van Neck JW,et al.Natural conduits for bridging a 15-mm nerve defect: Comparison of the vein supported by muscle and bone marrow stromal cells with a nerve autograft[J].J Plast Reconstr Aesthet Surg,2013,66(2):251-259.

26 Hu N,Wu H,Xue C,et al.Long-term outcome of the repair of 50 mm long median nerve defects in rhesus monkeys with marrow mesenchymal stem cells-containing,chitosanbased tissue engineered nerve grafts[J].Biomaterials,2013,34(1):100-111.

27 Frattini F,Lopes FR,Almeida FM,et al.Mesenchymal stem cells in a polycaprolactone conduit promote sciatic nerve regeneration and sensory neuron survival after nerve injury[J].Tissue Eng Part A,2012,18(19-20):2030-2039.

28 McGrath AM,Brohlin M,Kingham PJ,et al.Fibrin conduit supplemented with human mesenchymal stem cells and immunosuppressive treatment enhances regeneration after peripheral nerve injury[J].Neurosci Lett,2012,516(2):171-176.

29 Ishikawa N,Suzuki Y,Dezawa M,et al.Peripheral nerve regeneration by transplantation of BMSC-derived Schwann cells as chitosan gel sponge scaffolds[J].J Biomed Mater Res A,2009,89(4):1118-1124.

30 Hsu SH,Chan SH,Weng CT,et al.Long-term regeneration and functional recovery of a 15mm critical nerve gap bridged by tremella fuciformis polysaccharide-immobilized polylactide conduits[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:959261.

31 Ding F,Wu J,Yang Y,et al.Use of tissue-engineered nerve grafts consisting of a chitosan/poly(lactic-co-glycolic acid)-based scaffold included with bone marrow mesenchymal cells for bridging 50-mm dog sciatic nerve gaps[J].Tissue Eng Part A,2010,16(12):3779-3790.

32 Xue C,Hu N,Gu Y,et al.Joint use of a chitosan/PLGA scaffold and MSCs to bridge an extra large gap in dog sciatic nerve[J].Neurorehabil Neural Repair,2012,26(1):96-106.

33 Zheng L,Cui HF.Enhancement of nerve regeneration along a chitosan conduit combined with bone marrow mesenchymal stem cells[J].J Mater Sci Mater Med,2012,23(9):2291-2302.

Role of bone marrow mononuclear cells in peripheral nerve repair

Chen Lin,Huang Hongyun,Ao Qiang,Zuo Huancong,Zhang Yuqi.Tsinghua University Medical Center (Chen Lin,now Tsinghua University Yuquan Hospital).Beijing 100084,China

Huang Hongyun,Email:hongyunh@gmail.com; Ao Qiang,Email: aoqiang@mail.tsinghua.edu.cn

Preclinical researches have demonstrated that transplantation of many kinds of cells has a capability to promote the restoration of peripheral nerve injury.Of them,bone marrow mononuclear cells (BM-MNC) are an important candidate because of many advantages including rich source,easy and simple isolation,no infection risk,and no immune rejection.In order to encourage the clinical translational application from the basic researches,here,we review the latest studies of the action mechanism of bone marrow mononuclear cells for nerve repair,the most recent progress of the implant of BM-MNC to repair damaged peripheral nerve,as well as a variety of tissue-engineered nerve conduit built with the biological materials with BM-MNC.

Bone marrow；monocytes；peripheral nerve；injury；cell transplantation

2014-06-09)

（本文编辑：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2014.04.012

100084 北京，清华大学医学中心（陈琳，现在清华大学玉泉医院）；首都医科大学附属北京康复医院神经修复中心（黄红云）；清华大学玉泉医院神经外科（左焕琮、张玉琪）

黄红云，Email：hongyunh@gmail.com，敖强，Email：aoqiang@mail.tsinghua.edu.cn

陈琳,黄红云,敖强,等.骨髓单个核细胞在周围神经修复中的应用[J/CD].中华细胞与干细胞杂志：电子版,2014,4(4):284-288.