肝豆状核变性的分子遗传学研究进展

沈博 陈晨 吴瑢 肖佳佳 王晓平

肝豆状核变性的分子遗传学研究进展

沈博 陈晨 吴瑢 肖佳佳 王晓平

肝豆状核变性（hepatolenticular degeneration，HLD）又名威尔逊病（Wilson disease，WD），为7基因缺陷导致的一种常染色体隐性疾病，在国际上属于罕见疾病，在中国是神经系统遗传病中仅次于肌营养不良的第二常见疾病。其特征为胆汁铜排泄和肝内铜蓝蛋白合成障碍导致过量的铜在肝脏、脑、角膜等组织器官内积蓄，导致肝病及锥体外系症状等肝外表现。早期诊断与排铜治疗对改善WD患者预后意义重大，然而该疾病复杂的表现型使其诊断颇为困难，不同个体间的疾病转归也可迥异。近十年来，分子遗传学方法与临床疾病研究的结合愈发紧密，从分子水平准确识别并预测疾病的发展，进而采取更为有效的个体化干预，是分子遗传学研究向临床转化的核心。本文就WD的分子遗传学研究现状进行简要综述。

肝豆状核变性；铜蓝蛋白；基因型；表现型；基因诊断。

肝豆状核变性（hepatolenticular degeneration，HLD）又名威尔逊病（Wilson disease，WD），是7基因缺陷导致的一种致命性常染色体隐性遗传病，该疾病在全球范围内均有分布，好发于儿童及青少年，3～80岁均有报道。男性患病率略高于女性，这可能是雌激素水平以及铁代谢差异的结果［1］。经典的WD患病率约1/30000，携带频率约0.011，基因频率约0.56。最近一项英国的临床研究对 WD发病率重新进行了评估，当地随机抽选的6000余人分别采取7基因全长和热区8、14和18号外显子直接测序，前者携带频率为0.024～0.056，后者则仅为0.0044～0.0057，这意味着理论上WD的患病率不应低于1/7000，确诊病例数与理论发病率的差距可能来源于外显率下降与诊断的局限性［2］。

WD的临床表现高度多变，主要分为肝型和神经型，肝型表现为急、慢性肝病，如爆发性肝衰竭（fulminant hepatic failure，FHF）、肝硬化等，神经系统症状主要包括运动障碍和肌张力障碍的椎体外系症状，精神症状多伴随神经症状出现，主要表现为认知、心境异常［3］，少数患者还可出现溶血性贫血和骨骼肌肉异常。

WD患者一经确诊，需要终身接受低铜饮食并排铜治疗，绝大多数患者症状得到改善，生活质量能够明显改善。

1 WD的基因

我国的突变热区分布于2、5、8-13、16、18、19号外显子，有研究者在对73位南方WD患者的7完整测序后，发现32位患者存在R778L突变（34/146，23.29%），次常见突变类型为I1148T（14/146，9.59%）［4］；随后另有研究者对我国北方WD患者的基因型研究中进一步证实R778L突变与L770L连锁紧密，是我国最常见的突变类型，其余常见的突变还包括A874V和P992L［5］。

2 ATP7B蛋白的结构和功能

铜作为人体内重要的微量元素，处于稳态时参与线粒体呼吸链、神经递质合成以及铁代谢等重要的细胞代谢过程，一旦过度蓄积则通过Haber-Weiss反应加速活性氧生成，对细胞DNA、线粒体造成氧化损伤，诱导细胞凋亡。当肝细胞胞内铜浓度正常或偏低时，胞浆内铜离子泵入TGN，与前铜蓝蛋白结合形成一种6分子铜结合蛋白，即完全铜蓝蛋白，后者将血浆中95%以上的铜转运至各器官。高铜环境下铜离子则以膜泡形式从肝细胞分泌至胆小管，通过胆汁排出体外，维持胞内铜稳态。ATP7B功能结构一旦受损即可出现铜蓝蛋白下降和肝铜超载，进而引发各类WD临床表现。

3 WD基因型-表现型关联

WD的表现型十分复杂，可概括为起病年龄范围广，临床表现多样以及代谢紊乱程度差异大。一方面，7多达500余种突变对ATP7B的结构功能所造成的影响并不相同：结构影响如ATP7B完整性丧失、错误折叠、蛋白间作用受损，功能影响如磷酸化或铜转运异常，ATP结合力下降，胞内转运障碍等［8］。另一方面，可能还存在7之外的修饰基因，证据在于WD基因型相同的WD患者，甚至同卵双生子之间也可能存在迥异的表现型［9］。此外，线粒体DNA突变以及环境作用也会对WD表现型造成重要影响。

E1064同样位于N区SEHPL模体，该突变可导致ATP结合力完全丧失而出现症状严重的临床表型，据报道1例16岁E1064K纯合的男性WD患者表现出致死性FHF［15］。然而，尽管该突变与其下游的H1069位点非常临近，却并未改变N区的蛋白折叠，且E1064A突变体的热稳定性和胞内定位与野生型相比并无明显异常［16］。

R778L位于8号外显子，等位基因频率在14%～49%［11］。位于M2跨膜螺旋体的精氨酸残基被亮氨酸替换，可能影响Cu+的跨膜运输。R778L与L770L高度连锁，这种东亚特有的单倍型可能来自5500年前的共同祖先［17］。我国学者Liu等［18］的两组研究报道均提示R778 L突变与肝型WD相关，值得注意的是，两次研究中纳入的患者起病年龄较轻，分别为16岁前起病占55/57，18岁前起病占72/75，这可能造成研究结论的偏倚。

M区的G943S和M769 V突变体表现为铜代谢异常，而其血浆铜蓝蛋白水平多正常。撒丁岛人群的常见突变为启动子区-441/-427del，可能通过改变ATP7B的表达水平导致WD的发生。移码突变、无义突变，插入缺失及剪切点突变等常造成编码蛋白截断，导致起病时间更早，代谢异常更为严重，表现为FHF等严重临床表型也更多见［19］。

3.2 修饰基因 修饰基因是加重或缓解其他致病基因表型的一组基因。位于19q13.2的apoE是与WD相关性最强的修饰基因，该基因座主要存在ε2、ε3、ε4三种共显性基因，ε3、ε3/3分别为最常见的等位基因和基因型，其编码载脂蛋白E，在脂质代谢中发挥重要作用。ε4被认为与脂质紊乱、神经退行性疾病，如阿尔兹海默病的发生有关。有研究表明基因型为ε3/3的WD患者起病年龄较晚，可能是载脂蛋白E3具有抗氧化及神经修复功能的保护效应［20］。Litwin等［21］的研究成果显示：ε4阳性的女性WD患者与野生型ε3/3相比平均起病时间早4年，且在H1069Q纯合子的患者中更为明显。该研究者推测，雌激素对神经生长所具有的保护效应只在ε3/3基因型中生效，而ε4阳性基因型剥夺了这一保护机制造成机体对毒性物质耐受力下降。

朊病毒相关蛋白曾在体外研究中被证实具有铜离子结合能力，可能参与人体铜稳态的调节。编码该蛋白的PRP基因129密码子存在多态性，此处的蛋氨酸（M）如被缬氨酸（V）替代可以导致WD起病时间提前约5年，但不改变症状表型［22］。

关于WD基因型-表型联系的研究中大多数结论尚未有定论。一方面，确定起病年龄及临床表型绝非易事，常因接诊医生的差异而具有明显的主观性；另一方面，因为WD发病率偏低，更为罕见的基因型只能通过生物信息学技术或异种同源蛋白进行预测，难以在统计学上与表现型建立关联。此外，疾病表现型不能简单还原为特定的基因型，而是亚细胞水平动态的、复合的外显。建立基因型-表型关联有赖于更实用的 WD临床分型，更广泛的科研临床合作以及更深入的分子机制研究。

4 WD基因诊断的方法与评价

由欧洲肝脏病学会出台的最新肝豆状核变性治疗指南中，基因检测阳性在诊断量表中被赋予了最高的权重［25］。WD的基因检测方法可以分为直接测序和单体型分析两大类。直接测序能够明确突变的具体类型，是目前诊断WD的标准方法，由于WD基因外显子区长达4.3 kb，通常仅针对突变热点测序以期在保证准确性的同时实现高效经济。单体型分析是通过靶基因内部或侧翼的分子标记实施检测获取遗传信息，通常选用7侧翼的微卫星序列或其内部SNP位点做标记，单体型分析不需要明确突变类型，适用于对已经确诊WD患者的亲属进行筛查，其缺点在于对低概率基因重组可能造成假阴性结果。此外，新一代测序技术能实现全外显子乃至全基因组测序，未来WD的基因诊断必将更及时而全面。

WD传统诊断依赖临床症状和生化指标，然而，同时出现血清铜蓝蛋白水平降低、神经系统与角膜K-F环三联征的患者并不多见，大部分患者早期仅为不明原因的肝功能异常或铜蓝蛋白水平下降，此时基因检测结果往往起决定性作用［26］。未经治疗的WD致死率极高，对确诊WD患者的亲属实行基因检测可以避免对杂合子实施不必要治疗。目前 WD的产前诊断尚未列入常规推荐。然而，鉴于7基因具有明显的异质性，启动子等非翻译区突变也屡有报道，基因诊断的阴性结果并不能完全排除WD的可能。进一步确立WD高频突变类型和地域、人种及疾病表型的关系将非常有助于提高基因诊断的准确性与实用性。

总之，WD在我国较为常见，是目前少数能得到有效治疗的神经遗传病。早期诊断及排铜治疗能显著改善这类患者的预后，如何做到早期识别诊断、准确预测病程进展并采取有效治疗，是分子遗传学研究向临床转化的切入点。目前对于WD基因型-表现型关联的报道大都效力不足，进一步开展分子遗传学研究从分子层面阐明疾病机制，可能更将有助于临床基因诊断，为干细胞移植、基因治疗等新兴治疗方式提供助力。

［1］Litwin T，Gromadzka G，Czlonkowska A.Gender differences in Wilson's disease［J］.J Neurol Sci，2012，312（1-2）：31-35.

［2］Coffey AJ，Durkie M，Hague S，et al.A genetic study of Wilson's disease in the United Kingdom［J］.Brain，2013，136（Pt 5）：1476-1487.

［3］王晓平，蒋玉美，李文杰.几种基底神经节相关疾病的神经精神症状［J］.中国神经免疫学和神经病学杂志，2010，4：286-289.

［4］Wang LH，Huang YQ，Shang X，et al.Mutation analysis of 73 southern Chinese Wilson's disease patients：identification of 10 novel mutations and its clinical correlation［J］.J Hum Genet，2011，56（9）：660-665.

［5］Li K，Zhang WM，Lin S，et al.Mutational analysis of ATP7B in north Chinese patients with Wilson disease［J］.J Hum Genet，2013，58（2）：67-72.

［6］Hatori Y，Majima E，Tsuda T，et al.Domain organization and movements in heavy metal ion pumps：papain digestion of Cop A，a Cu+-transporting ATPase［J］.J Biol Chem，2007，282（35）：25213-25221.

［7］Gourdon P，Liu XY，Skjorringe T，et al.Crystal structure of a copper-transporting PIB-type ATPase［J］.Nature，2011，475（7354）：59-64.

［8］Huster D，Kuhne A，Bhattacharjee A，et al.Diverse functional properties of Wilson disease ATP7B variants［J］. Gastroenterology，2012，142（4）：947-956；e5.

［9］Czlonkowska A，Gromadzka G，Chabik G.Monozygotic female twins discordant for phenotype of Wilson's disease［J］. Mov Disord，2009，24（7）：1066-1069.

［10］Lee BH，Kim JH，Lee SY，et al.Distinct clinical courses according to presenting phenotypes and their correlations to ATP7B mutations in a large Wilson's disease cohort［J］.Liver Int，2011，31（6）：831-839.

［11］Ferenci P.Regional distribution of mutations of the ATP7B gene in patients with Wilson disease：impact on genetic testing［J］.Hum Genet，2006，120（2）：151-159.

［12］Rodriguez-Granillo A，Sedlak E，Wittung-Stafshede P.Stability and ATP binding of the nucleotide-binding domain of the Wilson disease protein：effect of the common H1069Q mutation［J］.J Mol Biol，2008，383（5）：1097-1111.

［13］Stapelbroek JM，Bollen CW，van Amstel JK，et al.The H1069Q mutation in ATP7B is associated with late and neurologic presentation in Wilson disease：results of a meta-analysis［J］.J Hepatol，2004，41（5）：758-763.

［14］Mihaylova V，Todorov T，Jelev H，et al.Neurological symptoms，genotype-phenotype correlations and ethnic-specific differences in Bulgarian patients with Wilson disease［J］. Neurologist，2012，18（4）：184-189.

［15］Firneisz G，Szonyi L，Ferenci P，et al.The other mutation is found：follow-up of an exceptional family with Wilson disease［J］.Am J Gastroenterol，2004，99（12）：2504-2505.

［16］Dmitriev OY，Bhattacharjee A，Nokhrin S，et al.Difference in stability of the N-domain underlies distinct intracellular properties of the E1064A and H1069Q mutants of coppertransporting ATPase ATP7B［J］.J Biol Chem，2011，286（18）：16355-16362.

［17］Mak CM，Lam CW，Tam S，et al.Mutational analysis of 65 Wilson disease patients in Hong Kong Chinese：identification of 17 novel mutations and its genetic heterogeneity［J］.J Hum Genet，2008，53（1）：55-63.

［18］Liu XQ，Zhang YF，Liu TT，et al.Correlation of ATP7B genotype with phenotype in Chinese patients with Wilson disease［J］.World J Gastroenterol，2004，10（4）：590-593.

［19］Okada T，Shiono Y，Kaneko Y，et al.High prevalence of fulminant hepatic failure among patients with mutant alleles for truncation of ATP7B in Wilson's disease［J］.Scand J Gastroenterol，2010，45（10）：1232-1237.

［20］Wang XP，Wang XH，Bao YC，et al.Apolipoprotein E genotypes in Chinese patients with Wilson's disease［J］.Qjm，2003，96（7）：541-542.

［21］Litwin T，Gromadzka G，Członkowska A.Apolipoprotein E gene（APOE）genotype in Wilson's disease：impact on clinical presentation［J］.Parkinsonism Relat Disord，2012，18（4）：367-369.

［22］Merle U，Stremmel W，Gessner R.Influence of homozygosity for methionine at codon 129 of the human prion gene on the onset of neurological and hepatic symptoms in Wilson disease［J］.Arch Neurol，2006，63（7）：982-985.

［23］Gromadzka G，Rudnicka M，Chabik G，et al.Genetic variability in the methylenetetrahydrofolate reductase gene（MTHFR）affects clinical expression of Wilson's disease［J］.J Hepatol，2011，55（4）：913-919.

［24］Gromadzka G，Członkowska A.Influence of IL-1 RNIntron 2 variable number of tandem repeats（VNTR）polymorphism on the age at onset of neuropsychiatric symptoms in Wilson's disease［J］.Int J Neurosci，2011，121（1）：8-15.

［25］European Association for Study of L.EASL Clinical Practice Guidelines：Wilson's disease［J］.J Hepatol，2012，56（3）：671-685.

［26］周怡言，王晓平.低铜蓝蛋白血症及基因研究的进展［J］.中华神经科杂志，2012，45（6）：429-431.

R742.4

：A

：1006-2963（2014）06-0437-04

2014-02-16）

（本文编辑：邹晨双）

10.3969/j.issn.1006-2963.2014.06.015

200080上海交通大学附属第一人民医院神经科

王晓平，Email：x_p_wang@sjtu.edu.cn