天然免疫分子抗菌肽的作用机制和临床应用

安泰，徐瑜，陈博，郑鑫，林海龙



天然免疫分子抗菌肽的作用机制和临床应用

安泰，徐瑜，陈博，郑鑫，林海龙

102209 北京，中粮营养健康研究院有限公司

抗生素的发现被认为是医学史上最伟大的成就之一，在感染性疾病临床治疗中曾经给患者带来福音。但近年来，随着抗生素在各领域的滥用，细菌耐药已成为全球公共健康领域面临的严峻问题，因此人们一直试图通过新的手段或者可替代的药物来解决抗生素耐药性问题。“天然抗生素”抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）被认为是先天免疫系统中非常重要的一类物质，它的发现与应用将为未来解决此问题提供潜在的可能。到目前为止，多达 5000 种抗菌肽已经被发现或合成[1]。天然的抗菌肽广泛分布在原核生物（如细菌）和真核生物（如原生动物、真菌、植物、昆虫和其他动物）中。对于动物来说，抗菌肽主要分布在暴露于接触病原体的组织和器官表面上，并且被认为是抵抗细菌、病毒和真菌的先天免疫反应的第一道防线[2-3]。基于以上特性，抗菌肽在医药和农业方面有着广阔的应用前景。本文结合国内外抗菌肽的最新研究进展，从抗菌肽的理化性质、抑菌和免疫机制以及临床研究等方面进行论述，为抗菌肽的研发和应用提供理论依据。

1 理化性质及抑菌机制

抗菌肽是由约 100 个氨基酸组成的小分子短肽，不同的氨基酸序列组成使抗菌肽呈现出特定的结构特征和不同的理化性质，形成一种低抗原活性的免疫防御机制。这类带正电荷极性和疏水性残基较多的两性短肽分子可以很好地与微生物膜表面磷脂进行非特异性相互作用[4-5]，这种短时间与微生物的相互作用可以使微生物快速死亡，并且耐药菌株的产生大大降低。按结构差异，抗菌肽可以分为三类：α-螺旋类（如天蚕素）、富含半胱氨酸类和 β-片层类（如防御素）。通常组氨酸、精氨酸、脯氨酸和色氨酸是抗菌肽中含量较高的几种氨基酸[6]。

研究发现，抗菌肽对革兰阳性菌和革兰阴性菌具有很强的抑菌效应，并对真菌、原生动物以及具有包膜的人类免疫缺陷病毒和疱疹病毒也有防御作用[7]。其机制是通过特殊的理化性质破坏和渗透入细胞膜表面，达到杀死细菌的作用，其穿透膜表面的能力与抑菌能力是直接相关的。这些特殊的理化性质包括肽的二级结构、静电荷、两亲性、疏水性和肽的大小等[6-8]。抗菌肽对细胞膜表面的破坏主要通过磷脂双分子层形成孔道使细胞膜破裂，还有研究发现抗菌肽利用其与核酸和蛋白的结合能力与病原体胞内的特定靶点发生相互作用[9-10]。抗菌肽在体外试验中对微生物的最小抑菌浓度往往高于其在生理状态下的抑菌浓度。抗菌肽如何在体内能以较低的浓度产生抗菌作用，一种解释是抗菌肽可以产生协同抗菌作用；而另一种更被认同的解释是抗菌肽通过一种间接的方式保护宿主而非简单的杀菌作用，这就是抗菌肽的免疫调节功能。

2 调节宿主免疫反应

抗菌肽是生物在长期进化过程中为适应环境而产生的免疫分子。当宿主受到病原微生物感染后，处于感染或受损部位的细胞会释放抗菌肽进行抵抗。抗菌肽除了能够抑制微生物的生长增殖，还能作为免疫效应分子，直接招募淋巴细胞或介导趋化因子和细胞因子的表达，从而间接提高效应细胞如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、未成熟树突状细胞和 T 淋巴细胞等的招募能力。因此，抗菌肽对宿主免疫反应调节起重要作用。如在无脊椎动物和脊椎动物中存在的抗菌肽 cathelicidin，由于其在人体内编码一个 18 kD 大小的非活性前体蛋白，因此被命名为 hCAP18。在人中性粒细胞中，hCAP18 被加工成由 37 个氨基酸残基组成且 N 端含有 2 个亮氨酸的 α-螺旋阳离子肽，被称为 LL-37。LL-37 在中性粒细胞、肥大细胞以及皮肤、内脏、腺体和附睾的上皮细胞中均有表达[11]。当宿主感染病原微生物或机体受损时，cathelicidin 能够直接作为免疫细胞的趋化因子，募集其到感染部位，从而发挥抗感染的作用[12]。此外，LL-37 还可通过调节免疫细胞释放趋化因子和细胞因子，从而间接产生趋化作用[13]。例如，LL-37 可以促进人外周血单核细胞分泌大量的 IL-1β，从而间接介导 IL-6 和 IL-10、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和单核细胞趋化蛋白-3（MCP-3）的表达[14]。

防御素是一组抗菌肽，体外实验表明其在机体免疫功能的调节过程中发挥重要作用。根据保守区半胱氨酸和二硫键的位置不同，哺乳动物防御素可以分为三个亚家族，即α-防御素、β-防御素和 θ-防御素[15]。α-防御素分子链内的6 个半胱氨酸的连接位置分别为 Cys1-Cys6、Cys2-Cys4、Cys3-Cys5。β-防御素分子链内半胱氨酸的连接顺序为 Cys1-Cys5、Cys2- Cys4、Cys3-Cys6。θ-防御素的结构不同于前两者，会形成一个没有 N 端和 C 端的环状结构[16]。防御素在机体内主要起趋化作用，人 α-防御素 1 和人α-防御素 2可以募集单核细胞至炎症部位，发挥其免疫功能[17]；人 β-防御素 3 和人 β-防御素 4 是单核细胞和巨噬细胞的趋化因子[18]，人 β-防御素 2 是肥大细胞的趋化因子[19]。人 α-防御素和人 β-防御素对 T 淋巴细胞及未成熟树突状细胞有趋化作用，此趋化作用可被 CCR6 抗体抑制，提示防御素的趋化作用机制可能是通过其与 G 蛋白偶联受体 CCR6 的相互作用而实现的。防御素同样可以通过介导免疫细胞分泌趋化因子和细胞因子，从而间接产生趋化作用。例如，人 β-防御素 3 通过与单核细胞和树突状细胞上 TLR1 和 TLR2 的相互作用，介导 CD80、CD86 和 CD40 的表达，从而激活 MyD88 信号通路，使 IL-1 受体相关激酶磷酸化[20]。在人角化细胞中，人 β-防御素 2、人 β-防御素 3 和人 β-防御素 4 以及 LL-37 可以介导 ERK1/2 和 p38 MAPK 信号通路的磷酸化，ERK1/2 的激活会导致下游转录因子 Elk-1 的激活，增加 IL-18 的分泌，使 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞和 TK 细胞能够过表达干扰素-γ，增加 CD4+T 淋巴细胞中 IgE 的表达，放大免疫反应[21]。

综上所述，cathelicidin 和防御素调节机体免疫应答的方式是直接作为抗菌物质被机体释放发挥抗菌作用、自身作为趋化因子进行免疫调节或者通过介导免疫细胞释放细胞因子而间接发挥趋化作用。

3 抗菌肽与疾病

目前研究证明抗菌肽作为一种具有多种免疫效应的物质，在疾病的发生和发展过程中具有至关重要的作用。

dermcidin 1 是一种体表汗腺持续分泌的天然抗菌肽[22]，在特应性皮炎患者的皮损组织中发现 dermcidin 1 表达水平与正常人相比显著降低，这些患者缺失该抗菌肽的免疫屏障导致其与正常人群相比更易受到微生物的感染。

另外，患有播散性神经性皮炎的患者易感染金黄色葡萄球菌，这些患者的人β-防御素 2、人 β-防御素 3 以及 cathelicidin LL-37 的表达水平显著下降[23]。

在正常皮肤表面，LL-37 会行使正常的生理功能，然而，LL-37 的异常高水平表达会引起红斑痤疮的发生，同时，在这些患者中发现 LL-37 的剪切加工过程也与正常人存在差异，提示该疾病的发生机制可能与 LL-37 翻译后修饰过程的异常有关[24]。

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，其发生机制与自身反应性 T 细胞的局部活化及表皮角质形成细胞的异常增殖分化密切相关。研究发现银屑病皮损表面 cathelicidin 的表达水平异常升高，正常情况下，细胞凋亡产生的 DNA/RNA 可被自身降解，并不引起炎症反应，然而在银屑病患者皮损部位大量表达的 LL-37 可以破坏机体对自身 DNA/RNA 的天然免疫耐受，LL-37 与之形成复合物，该复合物会被转运至浆细胞样树突状细胞，激活 TLR-9 并诱导干扰素-α 的产生，从而引起银屑病的发生[25]。

LL-37、人 α-防御素和人 β-防御素以及 histatin 等抗菌肽作为口腔中对病原体的第一道防线也起着十分重要作用。而这几种抗菌肽的异常表达会导致各种口腔疾病的发生，例如人 β-防御素基因的单核苷酸多态性会导致患有 I 型糖尿病的患者口腔中白色念球菌高于对照组[26]，而在口腔中 LL-37 的缺乏也会导致患有科斯特曼病（Morbus-Kostmann）的患者口腔细菌感染和牙周系统疾病发病频率增高[27]。另外有研究发现，口腔中人中性粒细胞多肽表达较高的儿童患有龋齿的可能性较低，这些发现提示正常的抗菌肽浓度对于控制口腔细菌生长有重要作用[28]。

正常人的肠道中抗菌肽与肠道微生物之间是保持平衡的，然而在克罗恩病（Crohn’s disease）的患者当中，由于人 β-防御素 2、人 β-防御素 3 和人 β-防御素 4 的表达水平不足，导致微生物可以侵入肠黏膜，从而导致炎症反应的发生。此外，一些研究发现当患者人 β-防御素 2 基因拷贝数低于 4 个时，肠黏膜中人 β-防御素 2 mRNA 水平将随之降低，提示防御素基因拷贝数的变化可能会影响个体对于感染的耐受水平，并且由于人 β-防御素 3 和人 β-防御素 4 的基因也位于相同的基因座位上，提示这两个基因可能也是由于类似的机制导致表达水平降低[29]。

4 抗菌肽的应用前景

到目前为止，已发现的抗菌肽高达上千种，其中数十种处在临床前或临床试验阶段。此外，有一些抗菌肽在临床应用中已取得了良好的疗效，且未发现明显的副作用。由此可见，抗菌肽是具有发展潜力的新型抗菌药物，它的出现将带来抗生素治疗领域的变革。

培西加南（pexiganan）是一个由 22 个氨基酸构成的爪蟾蛙皮素类似物，该多肽药物对治疗糖尿病引起的足坏疽感染十分有效。Genaera 公司在美国已完成培西加南治疗糖尿病足坏疽的 III 期临床试验，结果显示局部使用培西加南软膏与口服氧氟沙星相比，对于轻度糖尿病足坏疽的患者治疗效果没有明显差异，而相比于喹诺酮类抗生素，培西加南的不良反应较低。培西加南的作用机制可能与其可以同时抑制革兰阳性菌和革兰阴性菌感染有关[30]。

Novozyme 公司研发的抗菌肽菌丝霉素是从真菌中分离得到的一种防御素家族抗菌肽。2008 年，Novozyme 公司和 Sanofi-Aventis 公司签署了一份全球许可转让和合作协议，以开发和销售菌丝霉素NZ2114。研究发现，在动物模型中该抗菌肽对葡萄球菌引起的心内膜炎有较好的疗效[31]。

MU1140 是从口腔中生长的细菌中分离得到的羊毛硫氨酸抗菌肽。研究发现，MU1140 对处于活动期和休眠期的结核分枝杆菌均有良好的作用，相比于传统的抗结核药物，其不良反应较轻且不易产生耐药性，未来可能成为治疗肺结核的有效药物。此外，有研究表明 MU1140 对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和炭疽杆菌同样有着良好的作用。但 MU1140 的表达量较低，Oragenics 公司采用一种新技术以获得足够用于前期临床研究的抗菌肽。2012 年，Oragenics 公司与 Intrexon 公司合作共同生产和开发 MU1140 和其他羊毛硫酸抗菌肽。尽管 Oragenics 公司尚未对 MU1140 进行研究性新药申请，但是 MU1140 作为抗菌新药的前景还是较为明朗的[32]。

足部的真菌感染影响着全球 12% 的人口，一般的治疗策略为应用外用抗真菌软膏、口服深部抗真菌药物或者激光治疗，以上治疗策略存在治疗效果差、毒副作用高以及价格昂贵等问题。novexatin 是 NovaBiotics 公司基于人 α-防御素和人 β-防御素设计研发的一个环状、高精氨酸阳离子多肽。研究发现，此环形多肽不仅能够提高抗真菌能力，还能够提高抗菌肽的稳定性。2010 年，novexatin 已成功完成了 II 期临床试验[33]。

5 总结与展望

抗菌肽的研究虽取得了一些进展，并在部分临床实验中取得了良好的效果，但仍然有一些问题亟待解决。抗菌肽在临床前体外实验的研究中具有明显抑菌作用，但进入到临床试验中却难以达到传统抗菌药物的治疗效果，这说明抗菌肽体外和在体的抑菌效果有较大差异。此外，抗菌肽的安全性问题也应引起重视。抗菌肽对生物膜的破膜作用，可能会导致溶血现象。因而多数临床应用还仅局限在临床前期研究，进入临床研究的药物也多限制在外用药物上。

未来通过对抗菌肽作用机制的不断深入研究，进一步阐明其药理作用，提高抗菌肽的稳定性、减少抗菌肽的毒副作用将会使其更好地应用于临床。同时，抗菌肽对于宿主免疫活性调节的进一步研究与探索将会为抗菌肽在免疫疾病的临床应用提供明确的理论依据。更为详实的数据与科学依据将会不断得到判断和评估。总之，抗菌肽作为抗病原微生物的天然免疫系统的重要组成部分，其作为新药的价值和临床应用前景广阔。

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中粮集团应用基础研究与技术开发项目（2014-C2-F005）

林海龙，Email：linhl@cofco.com

2014-05-28

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.014